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Kartierung von Genen Meiotische Kartierung basiert auf der Tatsache der Crossing Overs während der Meiose Je weiter 2 Gene voneinander entfernt liegen, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit Einheit zur Messung von Genabständen: Centimorgan o Wenn zwei Gene 15cM entfernt sind voneinander heißt das,...

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Praktikumszusammenfassung Genetik SoSe2020

A. Preiß

Kartierung von Genen -

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Meiotische Kartierung basiert auf der Tatsache der Crossing Overs während der Meiose Je weiter 2 Gene voneinander entfernt liegen, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit Einheit zur Messung von Genabständen: Centimorgan o Wenn zwei Gene 15cM entfernt sind voneinander heißt das, dass die Eizellen eines heterozygoten Weibchens zu 85% die mütterliche Anordnung dieser beiden Gene auf dem Chromosom haben werden o In 15% der Eizellen ist es zur Rekombination gekommen Kreuzung mit 3 oder mehr Genen hilft bei der Abstandsbestimmung und Reihenfolge, aber nicht genaue physikalische Position auf dem Chromosom Kompliziert wird Ermittlung wegen Doppelcrossover o Interferenz I: Wird kleiner mit Abstand zweier Gene i.d.R o Als Maß gilt der Koeffizient der Koinzidenz o Beobachtet man statt 8 nur 2 DCO beträgt der Koeffizient 2/8= 0,25. Also haben nur 25% DCO stattgefunden. Umgekehrt: ¾ aller DCO wurden unterdrückt, die Interferenz betrug 75% Defizienzen helfen bei der physikalischen Lokalisierung Die sogenannten „Bruchpunkte“ der verwendeten Defizienzen müssen hierfür bekannt sein (Bruchpunkte sind die Stellen auf dem Chromosom, an denen die Defizienz anfängt und aufhört). o Chromosom mit Defizienz fehlt ein größerer Abschnitt der DNA o Gleiche Situation: Beide ct1 und ct1/Df(ct) o Entfernt man eine andere Stelle (Df m) hat das keinen Einfluss auf cut o Dadurch erfährt man, dass die cut in der Region liegt, die durch die Defizienz beim ersten Mal eben entfernt wurde o Je kleiner die Defizienz, desto genauer die Angabe zur Lokalisation Liegt eine Defizienz heterozygot vor, kann man dies an einer Ausbeulung der polytänen Chromosomen erkennen Auf der Basis des Bänderungsmusters der polytäne Riesenchromosomen lassen sich die Bruchpunkte der in einer Defizienz fehlenden Bereiche beschreiben Viele Mutanten in DM sind homozygot letal Damit Mutation durch Rekombination nicht verloren geht, verwendet man Balancerchromosomen o Tragen mehrere, verschachtelte Inversionen (Verhinderung von Crossover) o Tragen ein/mehrere dominante Marker (Nachweis im Individuum später) o Marker bei autosomal homozygot letal, bei X-Chromosom → Sterilität

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Entwicklungsgenetik -

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Mutanten werden untersucht, bei denen ein bestimmte Entwicklungszyklus unterbrochen wird Mutationen in der Segmentierung bei Drosophila sind an der Kutikula erkennbar durch die Zähnchenbänder Gene mit zygotischer Expression o Genprodukte ausschließlich von der Zygote, der Genotyp des Embryos entscheidet über seinen Phänotypen o Gap Gene ▪ Ersten Gene, die auf maternale Genprodukte reagieren ▪ Mutant: größerer a/p-Abschnitt fehlt, Bsp. Krüppel und Knirps o Paarregelgene ▪ Entfalten Wirkung in vorübergehend in Parasegmenten, sind gegenüber den Segmenten um ein halbes Kompartiment versetzt ▪ Mutant: Nur halb so viele Segmente wie Wildtyp (z.B. hairy) ▪ Alle geradzahligen Segmente fehlen → zum Beispiel even-skipped ▪ Alle ungeradzahligen Segmente fehlen → zum Beispiel fushi tarazu o Segmentpolaritätsgene ▪ a/p-Ausrichtung innerhalb des Segmentes ▪ Mutation: verändertes Polaritätsmuster, Deletionen Duplikationen ▪ Beispielsweise wingless und hedgehog, patched, engrailed Gene mit maternaler Expression o Werden von der Mutter während der Oogenese exprimiert und im Ei deponiert, aber erst im Embryo benötigt o Die Genprodukte der Mutter entscheiden komplett über den Phänotypen des Embryos, unabhängig vom Genotypen des Embryos selbst o Koordinatorgene ▪ 30 bekannt, diese in 4 Gruppen, 3 für a/p-Achse ▪ => Legen die Achsen des Embryos fest ▪ Ausfall Gen d/v → Dorsalisierung, zum Beispiel dorsal (dl) ▪ Ausfall Gen a/p → Ventralisierung, zum Beispiel cactus ▪ Bicoid, nanos, torso, torpedo Homöotische Gene o Verleihen jedem Segment eine spezifische Identität o Mutation in einem homöotischen Gen verändern die Identität eines oder mehrerer Segmente, aber nicht deren Anzahl o Homöotische Transformation → Segment nimmt Charakter eines anderen an o Lokalisiert in 2 Komplexen (ANT-C; BX-C) auf dem dritten Chromosom o Antennenentwicklung z.B. ist aber unabhängig von der Funktion der Gene Vollständige Penetranz: Alle Individuen desselben Genotyps haben auch denselben Phänotypen Variable Expressivität: Variation im Grad der Ausprägung eines Mutanten Merkmals Einfluss der Temperatur (Folien 52,53 aus Skript Vb zu Entwicklungsgenetik erklären das) o Permissiv: hauptsächlich Wildtyp tritt auf o Restriktiv: lediglich Mutante tritt auf 2

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Chromosomen -

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Speicheldrüsenchromosom bei DM sind polytäne Riesenchromosomen → transkriptionell aktive Interphase-Chromosomen Entstehen durch Endoreplikation der DNA in stark verkürzten Zellzyklen ohne M-Phase → Endomitosen 95% der DNA befindet sich in den Banden, 5% in den Interbanden Bandenzahl bei Drosophila bei 5.500, inzwischen 20000 Gene identifiziert Besonders aktive Bereiche erscheinen aufgelockert und bilden einen „Puff“ o Anzahl und Lokalisation stadienspezifisch: unterschiedliche Entwicklungsstadien weisen voneinander abweichende Puffmuster auf Grundlagen zur Entstehung der Polytänchromosomen o Schwesterchromatiden und homologe Chromosomen liegen parallel vor o Das centromernahe Heterochromatin aller Chromosomen ist zu einem gemeinsamen Chromosomenzentrum verklebt o Das Heterochromatin wird bei der Polytänisierung nur in geringen Umfang mitpolyänisiert, sodass es anteilmäßig in den Riesenchromosomen stark zurücktritt o Gibt 2 unterschiedliche Geschlechtschromosomen ▪ X-Chromosom ▪ Sehr kleines, genarmes, fast vollständig heterochromatische Y o X-Chromosom von Männchen in L3 nur halb so dick wie bei Weibchen, weil die Paarung beider homologen Geschlechtschromosomen entfällt DM ist diploid mit 2n=8, das heißt 4 Chromosomenpaare (1-4) 1 und 4 sind akrozentrisch → endständiges Centromer 2 und 3 sind metazentrisch → zentrales Centromer Posterior liegt das Kopfskelett, anterior die Filzkörper Praktikum o PBS → Präparation und waschen o Methanol-Eisessig → Fixierung o Orcein-Essigsäure → Färbung o Milchsäure-Essigsäure → Einbettung

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DNA-Fingerprint -

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Genetische Fingerabdruck wird dafür verwendet, das Erbgut bestimmter Personen auf Unterschiede und Gemeinsamkeiten hin zu untersuchen 99.9% Genom der Menschen ist circa gleich, der Fingerabdruck beschäftigt sich mit den verbleibenden 0.1% Besonderheiten In bestimmten Bereichen des Chromosoms sind anstelle von Genen sich oft wiederholende kurze Sequenzen lokalisiert in den nicht codierenden Bereichen; Unterscheiden sich in der Wiederholungsrate unter Individuen= VNTRs = Variable Number of Tandem Repeats Primer liegen außerhalb des variablen Bereichs, so dass dieser vollständig amplifiziert wird VNTR-Analyse bei Tätersuche oder Vaterschaftsanalysen Bayessche Theorem hilft bei dem Kombinieren von Einzelwahrscheinlichkeiten zu einer Gesamtwahrscheinlichkeit PCR → Polymerase chain reaction o Erlaubt die selektive Vermerhung einer spezifischen DNA-Sequenz zu sehr hohen Kopiezahlen innerhalb weniger Stunden o Benötigt werden DNA, Nukleotide, Primer, Pufferlösung, Polymerase o (Amplifikation), Denaturierung, Hybridisierung, Elongation, (sichtbar machen) o Eine PCR durchläuft mindestens 25 Zyklen mit einem Temperaturprofil von 96-7255°C o Anfärbung mit pEQGreen Präparation von DNA o 1. Lyse der Mundschleimhaut o 2. Denaturierung der Probe o 3. Fällen und Waschen der DNA o 4. Elution der DNA Gelelektrophorese o Physikalische Trennung von geladenen Molekülen o DNA-Fragmente wandern aufgrund der negativen Ladung ihrer Phosphatreste durch die Poren Richtung Anode (positiv) o pEQGreen interkaliert unter UV-Licht rosa-orange fluoreszierend

Krank 2%, Erkennung 90%, falsch 2% ➔ 15,5% Krank 10%, Erkennung 80%, falsch 10% ➔ 7,4% Krank 10%, Erkennung 85%, falsch 5% ➔ 14,7%

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Vererbung -

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Morphologie und Phänotypen o Weibliche Fliegen sind etwas größer als männliche Fliegen o Am posterioren Ende sind die Männchen etwas dunkler pigmentiert als die Weibchen o Posteriore Ende bei Männchen eher abgerundet, bei Weibchen spitz zulaufend o Jungfrau → frisch geschlüpft → hellere Bauchseite → Kutikula noch nicht ganz ausgehärtet o Am Aussagestärksten: Dunkle Geschlechtskämme am distalsten Beinsegment Tarsus (nur bei Männchen) → Festhalten bei Begattung des Weibchen Mutanten o Körper, Flügel, Augen, Borsten-Mutanten möglich o Ebony → schwarze Körperfarbe o Yellow → Gelbe Körperfarbe, „goldene“ Flügel o White → fehlende Pigmente, deshalb weiße Augen o Scarlet → Auge ist etwas mehr orange als rot, Pseudopupille nicht vorhanden o Brown → braune Augen o Bar → dominant, schlitzförmige/nierenförmige Augen o Vestigial → stark verkümmerte Flügel o Curly → Flügel stehen wie aufgerollt vom Thorax ab (Chromosom 2) o Stubble → kurze, dicke Borsten (Chromosom 3) o Singed → verkürzte, verdrehte Borsten (Singed = Angesenkt) o Forked → verkürzte, gegabelte Borsten Terminologie und Schreibweise o Alle genetischen Notationen werden kursiv dargestellt o Wildytpische Allele erhalten als Index ein + oder einen Allel-spezifischen Index o Gene, die gemeinsam auf demselben Chromosom lokalisiert sind, werden durch ein Komma getrennt o Liegen Gene unterschiedlichen Chromosomen, werden sie von links beginnend mit dem Chromosom 1 durch ein Semikolon voneinander getrennt o Rezessiv wird klein geschrieben, dominant groß Auf welchem Autosom liegt die rezessive Mutation o Um eine Mutation auf eines der beiden großen Autosomen zu kartieren, verwendet man Fliegenstämme mit dominanten, homozygot letalen Mutationen

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A. Preiß

QTL-Kartierung 1/2 -

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Erfordert das Vorhandensein von genotypischen und phänotypischen Informationen aller Individuen einer spaltenden Population Erfordert die relative Position der Marker zueinander Frage aus der Klausur: Was ist eine Genotypwahrscheinlichkeit und wofür wird diese eingesetzt? → Wahrscheinlichkeit des Auftretens der möglichen Genotypen, Bestimmen dieser (wie groß ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein AA und BB Genotyp vorliegt) (Klausur) Varianzanalyse: Welche Annahmen werden getroffen und mit welcher Methode können diese Datensätze kontrolliert werden? o Statistische Unabhängigkeit der Residuen, Normalverteilung der Residuen, Varianzhomogenität, Residuenanalyse (A: S.17 Skript zu QTL 2) Prinzip der Versuchsanlage (Allgemeingültig) o Wiederholung (Muss) ▪ Statistisch: Ohne Wiederholung kann die Fehlervarianz nicht geschätzt werden ▪ Prinzip: Man braucht mind. 2 Beobachtungen, um zu sehen ob diese auf Zufall oder systematischen Effekt beruhen o Randomisation (Muss) ▪ Statistisch: Stellt sicher, dass die stochastische Unabhängigkeit der Fehler gegeben ist ▪ Prinzip: Die Behandlungen (bsp. Verschiedene Genotypen) werden zufällig den Versuchseinheiten (bsp. Topfposition) zugeordnet werden ▪ Ziel: möglich unverfälschte, von systematischen Fehlern freie, unverzerrte Schätzwerte erhalten o Blockung (Kann) ▪ Statistisch: Fehlervarianz zu reduzieren, dadurch dass die Unterschiede zwischen den Blockmittelwerten in den Blockeffekt fallen ▪ Prinzip: Störfaktoren innerhalb eines Blocks variieren so wenig wie möglich, um gewisse Homogenität zu erreichen. Bewirkt eine Verkleinerung der Zufallsstreuung durch Ausschaltung bekannter oder vermuteter Faktoren, die bezüglich einer gegeben Fragestellung nicht interessieren Single sed decent: Idee, dass ab einer F2-Generation jede Pflanze einer Population jeweils nur einen Nachkommen in der nächsten Generation besitzt → balanciertes Verwandtschaftsverhältnis Programm R o Grafische Darstellung und die Repräsentation von statistischen Analysen o Vektor: Sammlung von mehreren Objekten desselben Datentyps o Matrix: Elemente in zwei Dimensionen arrangieren, wenn gleicher Datentyp o Wie wird entschieden, ob eine Beobachtung ein Ausreißer ist? → Mittels Residuenanalyse, Varianzhomogenität und Normalverteilung müssen vorliegen für weitere Varianzanalyse; liegen Datenpunkt ohne sinnvolle Erklärung von Datenwolke weg, werden diese entfernt (Anwendung von Datentransformationen) o Wann adjustierter Wert anstelle von einfachen Mittelwert → notwendig, wenn fehlende Werte im Datensatz vorliegen

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A. Preiß

QTL-Kartierung 2/2 -

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Qualitätskontrolle: Mit plot-Funktion kann eine Abbildung erzeugt werden, die Verteilung der fehlenden Werte genotypischer Daten zeigt, Verteilung der molekularen Markerloci über das Genom illustriert sowie Verteilung der phänotypischen Merkmalswerte in der Population verdeutlicht Um Signifikanzniveau zu bestimmen: Permutationstest o Phänotypische Werte werden relativ zu den genotypischen Daten permutiert o Permutiert → durcheinandergewürfelt o Werden noch QTL detektiert sind diese falsch-positive QTL o Prozess wird mehrere tausende Male wiederholt o Man wählt das Signifikanzniveau so, dass nicht mehr als x% (z.B.5%) falsch-positive QTL identifiziert werden

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