Grundlagen der Genetik - Zusammenfassung PDF

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Alle Vorlesungen zusammengefasst, ohne die Kreuzungen...

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Grundlagen der Genetik – Schmidt - Dogma der Molekularbiologie > > > >

Transkription ist die erste Ebene der Genregulation Aufbau des Genoms Genetischer Code Veränderung des genet. Materials (Mutationen/Rekombination)

- Proteine > Aus Aminsosäuren, verbunden durch Peptidbindung > Polypeptid = 20+ Aminosäuren > saure, basische, polare, hydrophobe Aminosäuren

- Struktur von Proteinen > > > >

Primär: Aminosäurensequenz Sekundär: a-Helix, ß-Faltblatt Tertiär: globuläre und Faserproteine Quartiär: Untereinheiten bzw. mehrere Polypeptide bilden Komplex

- Schwache Wechselwirkungen in Proteinen > > > >

H2-Brücken Ionenbindungen Hydrophobe WW Van-der-Waals-Kräfte

- Nucleinsäuren > Aus Nukleotiden (Base + Zucker + Phosphatrest), verbunden durch Phosphodiesterbindung > Zucker: Ribose/Desoxyribose > Base: Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin/Uracil

- DNA-Stränge > 2 Moleküle, nicht-kovalent gebunden, 1 Struktur > Zusammenhalt durch stacking force (hydrophobe WW), teils H 2-Brücken > Hyperchromizität = ssDNA absorbiert 40 % mehr UV-Licht bei 260 nm als dsDNA > DNA wird zu ssDNA wenn man sie erhitzt (z.B. bei PCR) > 3 Formen: A-, B- und Z-DNA, B-DNA gängig > Durchmesser: 2nm > Doppelwindung: 10 Basenpaare, 3,4 nm > Rechtsgängige Doppelhelix

- Aufbau einer Nukleinsäurekette > Verknüpfung der Nukleotide in 5´-3´-Richtung > Stränge antiparallel ausgerichtet, Komplementärstrang also in 3´-5´-Richtung > Nukleinsäureketten sind durch das Phosphatrückgrat negativ polarisiert

- Vergleich DNA und RNA DNA Träger der genet. Information

RNA Strukturelle/Funktionelle

Stabiler als RNA (Doppelhelix) Einfach Replikation

Eigenschaften (tRNa, rRNA, mRNA,…) Seltene Basen (z.B. Insosin), kompakt Kat. Funktionen und Aktivität0 (z.B. Ribozyme)

- Grund für Unterschiede von DNA und RNA > Unterschiedlicher oxidierter Zucker (an –Oh von C2) > –OH der Ribose sorgt für weniger Stabilität als DNA

- Untersuchung von DNA/RNA > > > > >

Zentrifugation Elektronenmikroskop PCR Absorption von UV-Licht Gelelektrophorese

- Modifikation von Nukleinsäuren > Exonukleasen: Abbau von außen, von beiden Richtungen möglich > Endonukleasen: Abbau von innen, an spez. Erkennungssequenz > Restriktionsendonukleasen: Abwehr von Viren > Ligasen: bilden Phosphodiesterbindung unter ATP-Verbrauch > Methylasen: Methylierung schützt eigene DNA vor Abbau > Phosphatasen/Kinasen: Spalten/Addieren P in 5´-3´-Richtung > Restriktions-/Modifikationssysteme: WW zwischen Abbau und Schutz der DNA von z.B. EcoRI

- Restriktionsenzym EcoRI > Erkennungssequenz ist Palindrom = identisches Doppelstück (5´-GAATTC-3´) > Es entstehen sticky ends = Enden stehen nach Schneiden über > blunt ends = Enden stehen nach Schneiden gleich (z.B. durch Smal)

- DNA-Replikation 1. Initiation: Entspiralisieren, H2-Brücken spalten durch Topoisomerase 2. Initiation: Doppelstrang trennen unter ATP-Verbrauch durch Helicase 3. Annealing: Durch Primase synthetisierte Primer binden am „origin of replication“ (oriC, Bakterien) bzw. dem „origin of recognition“ (Eukaryoten, ORC) 4. Elongation: Polymerase synthetisiert ab Primer bidirektional neue Stränge 5. Termination: Polymerase löst sich, komplementäre Stränge binden aneinander

- Regulatorische Enzyme bei Prokaryoten > DnaA = Initiator Protein, Entspiralisierung am oriC > DnaB = Helicase > DnaC = bringt Helicase in Position > SSB = „Single strand binding“, verhindert Bindung des getrennten und alten Strang durch Bindung von ssDNA > DnaG = Primase, synthetisiert Primer, Primer für Replikation in Prok. Und Euk. sind RNA´s

- Replikationsgabel > DNA-Polymerasen nutzen dNTP´s als Substrat für die Kondensationsprodukte DNA und dNDP > Leading strand: kontinuierlich Synthese des neuen Stranges in 5´-3´-

Richtung am Primer > Lagging strand: diskontinuierliche Synthese des neuen Stranges in 5´-3´Richtung, wobei die entstandenen Okazaki-Fragmente durch Ligasen verknüpft werden > Okazaki-Fragmente = Einzelstücke synthetisierte ssDNA

- Fehlerrate bei der DNA-Replikation > Einbau falscher Base ca. 10-5 > Proof-Reading (2 Exonukleasen an der DNA-Polymerase) > Mismatch-Reparatur  Fehlerrate ca. 10-9 = nahezu keine Fehler (Mutationen) bei der Replikation

- Eigenschaften der DNA-Polymerasen von E. coli Pol I Pol Pol III Molekülaufbau Monomer Monomer Heteromultimer Anzahl 400 unbekannt 10-20 Moleküle/Zelle 5´-3´+ + + Polymeraseaktiv ität 3´-5´+ + + Exonukleaseakti vität (proofreading) 5´-3´+ Exonukleaseakti vität (Primerabbau) Prozessivität 10 unbekannt >10.000 (Basen, bis sich Pol löst) > Pol I = RNA-Primer entfernen/durch DNA ersetzen und Reparaturfunktion > Pol III = eigentliche Replikation (deshalb so hohe Prozessivität)

- DNA-Polymerasen von Eukaryoten > = Primase, Polymerase Aktivität (5´-3´) > = Proof-reading, Exonukleaseaktivität (3´-5´) > = Dimerisierung > = ß-Klammer (2 ident. UE bilden Ring, Pol III bindet besser) >  = lädt DNA auf ß-Klammer, Replikation mitochondrialer DNA

- Replikationsmechanismus von Phagen > rolling circle Mechanismus = Strangbruch (nick) und Replikation von 3´-5´Richtung, wodurch der neue Strang den alten (außenliegenden) Strang verdrängt, welcher schließlich in Bakterien überführt werden kann (Transduktion)

- Übersicht zur Replikation von Genomen verschiedener Organismen

Genomgröß e

Organismus

Startstelle für Replikation

Länge der ReplikationsReplikationsein geschwindigk heit eit 4,6 * 106 bp E. coli 1 4600 kb 50000 bp/min 13 Mb Hefe 500 40 kb 3600 bp/min 160 Mb Drosophila 3500 40 kb 2600 bp/min 3000 Mb Maus 25000 150 kb 2200 bp/min > Anzahl der Startstellen für Replikation bestimmt Anzahl der möglichen Replikons

- Lizenz-Faktor-Modell für Eukaryoten > in Eukaryoten ist die Anwesenheit eines Proteins (Mcm6) im Zellkern notwendig, um die DNAReplikation einzuleiten > nach G1-Phase des Zellzyklus bindet Mcm6 an Chromatin, indem es seine Konformation ändert, dies verhindert multiple Replikationen der DNA

- DNA-Sequenzierung nach Sanger bzw. Kettenabbruchsynthese > Didesoxymethode nach Sanger = enzymatische Methode > Benötigt: DNA-Matrize, Primer, DNA-Poly, Nikleotide, Abbruch-Nukleotide, Thermozykler 1. Denaturierung 2. Annealing 3. Elongation bis Abbruchnukleotid (genau 1, abwechselnd A/T/G/C) 4. Wiederholungen mit jeweils 1 Abbruchnukleotid (radioaktiv markiert) 5. Gelelektrophorese 6. Ablesen der DNA-Sequenz nach Fragmentlänge 7. Umwandlung in Komplementärstrang!!

- Polymerase-Kettenreaktion (PCR) > gezielte Amplifikation von DNA-Fragmenten, wobei ein kurzer Sequenzabschnitt bekannt sein muss (für Primer) > mehrere Zyklen (20-50) im Thermocycler

- Ablauf des PCR-Zyklus 1. Denaturierung (96°C) = H2-Brücken der dsDNA werden gespalten 2. Annealing (ca. 68°C) = spez. Temperatur für Primerbindung, Primer im Überschuss 3. Elongation (72°C) = DNA-Poly synthetisiert Komplementärstränge, ungezielter Abbruch  Elektrophoretische Auftrennung des Produkts und Abgleich mit DNA-Leiter

- Eigenschaften des genetischen Codes > Triplett-Code, 64 Codons für 20 Aminosäuren > 3 mal STOPP = TAG, TGA, TAA  Nonsense-Codons > 1 mal START = ATG

- Grundlegende Eigenschaften > universell = gilt für alle Reiche des Lebens/Organismen > linear = Codons nacheinander aufgereiht > eindeutig = Codon codiert für eine AS > degeneriert = eine AS kann über verschiedene Codons codiert sein > Codon Bias/Codon Usage = untersch. Präferenz von Organismen von Codons für selbe AS, GC-Gehalt beeinflusst > dsDNA besitzt 6 Leseraster  „open reading frame“ (ORF), je nach Startpunkt des ersten Codon, pro Strang 3 Startpunkte für Transkription > bei der Transkription eines Gens kann dieses auf dem oberen oder unteren Strang liegen (je nachdem ändert sich auch die Transkriptionsrichtung der RNA‐ Polymerase), der Nicht‐ codierende‐Strang ist die Matrize (da die fertige mRNA diesem entspricht)

- Transkription bei Prokaryoten > Promotor = Anheftungsstelle der RNA-Polymerase, Startpunkt > Regulationssequenz (Repressor/Aktivator) = unterschiedliche Häufigkeit pro Gen > nicht-translatierender Bereich = Regulation der mRNA, Bindung am Ribosom 1. cis-Sequenz = vor/hinter codierenden Bereich 2. trans-Faktoren = Regulation der cis-Sequenzen > Terminator = Endpunkt > -35 und -10-Region = im Bereich des Promotor, Transkriptionsstartpunkt, ConsensusSequenzen (in allen Prokaryoten gleich)

- Prokaryotische RNA-Polymerase > E. coli besitzt nur eine RNA-Poly = Holoenzym aus 2, , ´, σ > bedeckt Bereich von 40-50 Basen > höhere Fehlerrate als DNA-Poly ( defekte RNA´s werden einfach abgebaut, es entstehen keine Mutationen, da die Fehler nicht die DNA betreffen) > 2, , ´ bilden den Core, σ variiert  Unterschiede der Polymerasen > = Zusammenbau, Bindung Promotor, WW mit Regulatoren > b = katalytisches Zentrum, Bindung Ribonukleotide > b´ = Bindung Matrize > σ = Promotorerkennung (-35-Region), Strangöffnung (-10-Region)

- Ablauf der prokaryotischen Transkription 1. Bindung an DNA 2. Bildung des offenen Promotorkomplexes (geschmolzene Bereiche enthalten viel AT) 3. σ-UE diffundiert ab 4. Initiation der RNA-Synthese (downstream) 5. Termination (Terminator wird mit abgelesen aber später nicht translatiert)

- Transkription bei Eukaryoten > Enhancer/Silencer = entfernungsabhängige Regulatorsequenzen, Enhancer verstärkt, Silencer reprimiert die Transkription, können auf mehrere Promotoren wirken, Feinregulation durch Zusammenspiel beider > URS = upstream regulating sequence ( cis-Sequenz) > TATA-Box = Kern des Promotors in der -30-Region > TBP = TATA-Box bindendes Proteinen > Mediator-Komplex = überträgt Transkriptionsfaktoren (TF´s) auf RNAPolymerase > TF´s = basal (binden an Promotor) oder regulatorisch (vor Promotor liegend) > TFIID = essentieller Proteinkomplex für Transkription fast aller Gene, bindet mit TRB am Promotor, fördert exakte Positionierung der RNA-Poly beim Ablesen, ermöglicht Bindung weiterer TF´s

- Aufgaben der verschiedenen RNA-Polymerasen > RNA-Poly I = transkribiert für rRNA > RNA-Poly II = transkribiert für mRNA > RNA-Poly III = transkribiert für kleine RNA´s (tRNA, 5S-RNA,…)

- Aufbau von TF´s  ist modular = 3 Domänen 1. DNA-bindende Domäne a) Helix-Turn-Helix b) Zink-Finger 2. Dimerisierung-Domäne a) Leucin-Zipper b) Helix-Loop-Helix 3. Aktivierungsdomäne

- Wie viele ORF´s besitzen Eukaryoten > keine, Eukaryoten besitzen Mosaikgene = codierende Exons + nichtcodierende Introns > Introns werden beim Splicing entfernt

- Hormone die Regulatoren der TF´s > Steroidhormone = kleine Moleküle, direkte Aktivierung > Polypeptidhormone = lösen Signalkaskade (diverse Phosphorylierungen) aus

- Ebenen der Genregulation 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Transkription RNA-Processing RNA-Transport Translation Proteine aktiv/inaktiv mRNA-Inaktivierung/-Abbau Chromatinstrukturen

- RNA-Arten

RNA

Größe Prokaryoten

Größe Eukaryoten

mRNA Prä-mRNA rRNA

variabel 2900 (23S) + 1540 (16S) 120 75 -

variabel variabel 4800 (28S) + 1900 ( 120 80-90 100-200

-

70-250

Pol III

-

variabel

Pol III

-

ca. 20

Pol III

5S-rRNA tRNA snRNA (small nuclear) snoRNA (small nucleolar) siRNA (small interfering) miRNA (micro)

Polymerase (Eukary.) Pol II Poll II Pol I Pol III Pol III Pol II + III

- Funktionen einiger RNA´s > Allgemein: ncRNA/snmRNA = nicht-codierende RNA/small non-messenger RNA > snRNA = Splicing von Introns > snoRNA = Processing der rRNA > siRNA = Genregulation > miRNA = Genregulation

- RNA-Processing 1. Schneiden und Trimmen 2. Prozessierung von tRNA in Eukaryoten  trimming, adding –CCA to 3´-end, splicing, Basenmodifikation 3. Basenmodofizierung z.B. Methylierung von prä-mRNA durch Methylasen Ab hier gilt das processing nur für Eukaryoten 4. capping am 5´-Ende der prä-mRNA (Stabilität und Bindestelle für Ribosom)  7-Methylguanosin wird 5´-5´ verknüpft, Abbau am 5´-Ende durch Nukleasen stark eingeschränkt, da 5´-5´-Bindung schwer spaltbar ist 5. Polyadenylierung am 3´-Ende der prä-mRNA (poly-A-Schwanz) durch Poly-APolymerase (Stabilität) 6. Splicing durch snRNA am Spliceosom  Alternatives Splicing möglich  eine prä-mRNA codiert mehrere Proteine Dieser Schritt wurde nur bei wenigen einzelligen Eukaryoten beobachtet 7. Editing, Einfügen von Basen in mRNA durch guide RNA (im Genom codiert)

- Ribosom > Komplex aus rRNA und Protein > große und kleine UE (Prok.: 30S + 50S = 70S ; Euk.: 40S + 60S = 80S)

- tRNA > besitzt Erkennungsstelle für AS > trägt Anticodon > Kleeblatt-Struktur

> > > >

enthält modifizierte Basen z.B. Pseudouracil, Inosin mRNA dient als Template (Codon) das 3´-Ende dient als Aminosäurebindestelle modifizierte Basen sind abweichend (kein A,U,G,C) dargestellt

- Beladung der tRNA > Aminoacyl-tRNA-Synthetasen (min. 1 pro AS) hängen richtige AS an tRNA > AS muss zuvor aktiviert werden > Aktivierung der AS durch Bildung einer Carbonsäure-PhosphorsäureAnhydrid-Bindung zwischen der AS und ATP, wobei AS-AMP (Aminoacyladenylat) und Diphosphat enstehen > die mit AMP verbundene AS kann auf das 3´-Ende übertragen werden, AMP spaltet sich ab > Reaktion: tRNA + AS + ATP  Aminoacyl-tRNA + AMP + Diphosphat

- Wobble-Base > an der 3. Basenposition der Anticodonschleife sind diverse Fehlerpaarungen möglich > spart tRNA´s ein > Organismus benötigt weniger tRNA-Synthetasen (da diese nur für eine AS gelten)

- Ablauf der Translation 1. Initiation = RBS der mRNA bindet an 16S der Ribosomen (Prokaryoten) bzw. CAP-Struktur der mRNA bindet an 18S der Ribosomen (Eukaryoten) > RBS = Ribosom-Bindestelle = Shine-Dalgarno-Sequenz  komplementär zur 16S UE > Nur bei Prok.: Bei Beginn des codierenden Bereichs (AUG) wir statt Methionin NFormylmethionin eingebaut, dies blockiert die Aminogruppe, legt Richtung fest (-COOH) 2. Elongation = Synthese der Aminosäurekette 3. Termination = Freisetzungsfaktor besetzt die A-Stelle, Translationskomplex zerfällt > Polysom = Polyribosom = mehrere Ribosomen sind an der Translation eines mRNAStranges beteiligt  eine mRNA erzeugt mehrere identische Proteine > Faltung der Proteine automatisch, Chaperone unterstützen dies bei Eukaryoten > Ribosomen sind Ribozyme = rRNA katalysiert Polypeptidsynthese

- Vergleich der Translation zwischen Prokaryoten und Eukaryoten Prokaryoten N-Formylmethionin RBS bindet an kleiner UE Schnell = 20 AS/s

Eukaryoten Methionin CAP-Struktur bindet an kleiner UE Langsam, da komplexer = 2-4 AS/s

- Aufbau eukaryotischer Genome > große Menge DNA verpackt in Chromosomen > Chromosomen sind in der Regel entspiralisiert (Chromatin sichtbar)

- Chromosom > aus 2 Chromatiden (2 DNA-Doppelhelices), welche dasselbe genetische Material haben > mit Centromer > an beiden Enden Telomere > Kinetochor als Anheftungspunkt für die Mikrotubuli des Spindelapparats

- Chromatin > 3 Hauptkomponenten = DNA, RNA, Proteine (Histone) > Histone = viel Arginin/Lysin, also basisch positiv polarisiert > Klassen von Histonen = H1, H2A, H2B, H3, H4  konservierte Proteine, da zentrale Funktion in jeder Zelle > (H2A, H2B, H3, H4)2 = Oktamer = Histonkomplex > WW der DNA mit dem Histonkomplex ist sequenzunabhängig (basiert auf Ladung) > Durchmesser der Nukleosomenkette ist 10 nm (vgl. Doppelhelix 2 nm) > Durch Herumwickeln der DNA um Histone wird ihre Länge auf 1/7 verkürzt > Nukleosomen spiralisieren wiederum zu Solenoiden, diese spiralisieren zu Chromosomen

- Arten von Chromatin > Euchromatin = aktiv, entspiralisiert > Heterochromatin = inaktiv und spiralisiert a) konstitutives = permanent spiralisiert b) fakultatives = kann heterochromatisch sein, abhängig von Zeitpunkt und Zelle > DNA ist nie vollständig entspiralisiert > Gendosis spielt entscheidende Rolle bei der Entwicklung (deswegen heterochromatisch und euchromatische Bereiche)

- Centromer bei z.B. E. coli > 3 Bereiche des Centromers auf je 16 Chromosomen seines Genoms > Bereich 2 ist sehr AT-Reich (leicht zu spalten) > Proteine lagern sich an 3 Bereiche an  Kinetochor entsteht

- Telomere > die ca. 10 letzten Basen des Folgestrangs können nicht synthetisiert werden, da Abschnitt zu kurz für Anlagerung der Primer > Folge = neu synthetisierte DANN bei jeder Replikation weiter verkürzt > Lösung: repetitive Sequenzen (tandem repeats)  Telomere > Telomerase (reverse Transkriptase) synthetisiert die fehlenden Abschnitte) > Reverse Transkriptasen sind RNA-abhängige DANN-Polymerasen

- Einteilung eukaryotischer DANN-Sequenzen > singuläre Sequenzen = einzelne Gendosis, wichtige Sequenzen > repetitive Sequenzen = mehrere Genkopien, Großteil der Sequenzen > transponierbare Sequenzen = deren Loci auf dem Genom variabel sind = springende Gene  Translokation oder durch Duplikation, machen rund 45 % des humanen Genoms aus, die meisten Sequenzen springe nicht mehr

- Beispiel einer VNTR (Minisatellit, repetitive Sequenz)

> Muster der VNTR´s dient als genetischer Fingerabdruck

- Beispiel für Retrotransposons > Alu-Sequenzen > codieren Introns

- Veränderungen des genetischen Materials 1. Mutation: in der Keimbahn (vererbbar) oder Soma (betrifft nur Individuum) 2. Rekombination

- Natürliche DNA-Schäden 1. Replikation  Einbau falscher Base  Mismatch (häufig Transition) a) Insertion/Adition b) Deletion  Frameshift 2. Spontane Läsionen a) Depurinierung b) Desaminierung (wenn nicht erkannt entsteht Hotspot für Mutationen) 3. Oxidative Schädigung a) z.B. Oxidation Guanin  Fehlpaarung zwischen G und T

- Induzierte Mutationen 1. Basenanaloga a) A/T  G/C b) 5-Brom-Uracil (Analog zu T)  Einbau G statt A (Transition) c) 2-Amino-Purin (Analog zu A)  Einbau C statt T (Transition) 2. Alkylierende Substanzen a) EMS b) MMS c) Nitrosamine  Transition 3. Interkalierende Substanzen a) Ethidiumbromid  macht DNA durch Fluoreszenz sichtbar b) Proflavin  Fehler bei der Replikation (Insertionen/Deletionen) 4. Kovalente Verbindungen zwischen Basen a) UV-Strahlung  Basen dimerisieren  Replikationsfehler 5. Ionisierende Strahlung  DNA-Brüche entstehen

- Reparaturmechanismen vor und während der Replikation 1. Direkte Reparatur a) Photolyse bei E. coli  trennt Dimere in Monomere b) Methyltransferase  Übernehmen Degradation 2. Basenexcisionsreparatur (BER)

a) Reparatur bei Schädigung eines Einzelstranges  Fehler vor Replikation entfernt 3. Nucleotidexcisionsreparatur (NER) a) XPA  erkennt Pyridmidin-Dimere (Mutation in XPA führt zu starker UVSensivität) 4. Mismatch-Reparatur a) dam-Methylase-Mechanismus in Prok.  methyliert A in der Sequenz GATC (Replikation) 5. Rekombinationsreparatur  beseitigt Dimere, Doppelstrangbrüche 6. End-joining Reparatur a) Ligase  wichtigster Reparaturmechanismus bei höheren Euk. für DNABrüche  fehlerbehaftete Reparatur  sticky ends  Verlust von Basen

- Post-Replikations-Reparatur speziell bei Prokaryoten a) Postreplication recombination repair  komplementärer Parentalstrang dient als Ersatzteil b) Error-prone (SOS) replication  ssDNA aktiviert Protein  bildet RecA (Protease)  Zelle versucht mit allen Mitteln Replikation zu erzwingen, nimmt Mismatch in Kauf

- Mutator-Stämme > Bakterienstämme mit einer Mutation in den MutS-Genen oder MutH-Genen > Erhöhte Mutationsrate bei diesen Stämmen, da diese Mutationen seltener repariert werden

- Mutationsarten 1. Punktmutationen a) Substitution  stumm, still, missense, nonsense b) Frameshift-Mutation  Deletion, Insertion c) Rückmutation  Reversion, Suppression 2. Chromosomenmutationen a) Deletion  Teil des Chromosoms fehlt (Ligase ligiert verbliebene Fragmente) b) Duplikation  ABC zu ABABC...