Genetik-Praktikum - Zusammenfassung Entwicklungsbiologie/Genetik PDF

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Experiment 1: Restriktionsverdau von Plasmid-DNA und InsertKartierung Restriktionsverdau von Plasmid DNA - Insert Kartierung Mit BamHI und HindIII werden Restriktionsverdaue des Plasmides “Pfn2-9.3-gen” durchgeführt; dann werden die Restriktionsschnittstellen der Enzyme kartiert. Plasmid •

In Bakterienzellen zusätzliche DNA neben dem Bakterienchromosom (=Kernäquivalent)

•

durch autonome Replikation extrachromosomal, da eigener Ori

•

ringförmiges, doppelsträngiges DNA-Molekül

• •

in einer Zelle können mehrere Plasmide vorkommen (=kompatibel) Plasmide können in das Bakteriengenom integriert sein (Episomen)

Klassifikation von Plasmiden 1. Fertilitäts-Plasmide 2. R (Resistenz)-Plasmide tragen Gene, die der Bakterienzelle Resistenz gegen Antibiotika verleihen. (z.B. Ampicillin-Resistenzgen)  R-Plasmide werden in der Gentechnik eingesetzt 3. Col-Plasmide 4. Degradative Plasmide 5. Virulenz-Plasmide Prinzip einer Gelelektrophorese •

Das Agarosegel enthält ein komplexes System von Poren, durch welche die DNAMoleküle wandern müssen, um den Pluspol zu erreichen.

•

Durch den Gel-Lauf werden die DNA-Moleküle nach der Größe getrennt

•

Supercoiled Form wandert weiter als lineare Form und nicked circle

Wirkungsweise von Aminopenicillin= Ampicillin •

ist ein β-Lactam-Antibiotikum: Blockierung der D-Alanin-Transpeptidase (Enzym für die Bildung neuer Zellwände) o

ß-Lactam-Ring bindet an die Aminosäuren des aktiven Zentrums des Enzyms

o

verhindert der Neusynthese der Zellwand

o bakteriostatische (wachstumshemmende) Wirkung Bakterien-Zellen sind somit teilungsunfähig, leben aber weiter Die Teilung menschlicher Zellen ist nicht behindert (menschliche Zellen besitzen keine Zellwand und daher auch keine D-Alanin-Transpeptidase) •

Das Ampicillin-Resistenzgen codiert für eine β-Lactamase (=Enzyme von Bakterien, die den β-Lactam-Ring hydrolysieren und so die Wirkung des Antibiotikums verhindern)

Das Plasmid Pfn2-9.3-gen trägt ein genomisches Fragment des Profilin2-Gens der Maus (das genomische Fragment wurde in die Plasmid-DNA inseriert). Profilin2 ist ein Aktin-bindendes Protein, das den Aufbau des Aktin-Zytoskeletts reguliert.

Plasmide ermöglichen als Vektoren die Klonierung von DNA: 1. das zu klonierende DNA-Fragment wird in den Plasmid-Vektor inseriert: a. Plasmid-Vektor und DNA-Fragment werden mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten; die überhängenden Enden finden sich durch Basenpaarung b. Vektor und Insert werden durch Ligation verbunden: die DNA-Ligase verschließt die Schnitte — rekombiniertes DNA-Molekül entsteht

Woran sieht man, dass ein Plasmid aufgenommen wurde? a.) Das bei der Verbindung von Plasmid-Vektor und DNA-Sequenz konstruierte rekombinierte DNA-Molekül ist ringförmig. b.) sichtbar durch Selektionsmarker: ein Gen, das als Marker zusammen mit dem „gene of interest“ in den veränderten Organismus eingebracht wird, um Individuen mit erfolgreicher Genveränderung erkennen zu können. Häufig verwendete Selektionsmarker sind Antibiotikaresistenzen. Erfolgreich genveränderte Organismen können dann auf einem die entsprechende Substanz enthaltenden Selektionsmedium überleben.

Restriktionsendonukleasen 

Restriktionsendonukleasen erkennen und spalten spezifische Stellen



(Erkennungssequenzen) auf der Doppelstrang-DNA (=Restriktionsverdau) 3 Typen: o

Typ II (für die Gentechnik von Bedeutung) schneidet die Polynukleotidkette direkt an der Erkennungssequenz  z.B. BamHI und HindIII 

BamHI und HindII erzeugen klebrige Enden (=an den Fragmentenden gibt es überstehende Einzelstrangabschnitte)

 o

bei BamHI und HindIII sind die Erkennungssequenzen palindromisch aufgebaut (obere Sequenz entspricht der unteren, aber revers)

Typ I & III bewegen sich noch eine Strecke an der DNA entlang, bevor sie die DNA spalten



Restriktionsendonukleasen sind Enzyme des bakteriellen Abwehrmechanismus gegen eingedrungene Fremd-DNA (Phagen-DNA).



Zu jeder Restriktionsendonuklease gehört eine Methylase, die die Bakterien-eigene DNA an der entsprechenden Erkennungssequenz methyliert, und damit vor dem Abbau schützt.

Das Prinzip einer Restriktionsanalyse 1. DNA-Moleküle werden mit Restriktionsendonukleasen behandelt es entstehen Fragmente unterschiedlicher Größe. 2. die Restriktionsfragmente werden im Agarosegel durch Anlegen eines elektrischen Feldes (elektrophoretisch) nach Größe aufgetrennt. 3. Da DNA negativ geladen ist, wandern die Fragmente zum Pluspol. o Kleine Fragmente wandern schneller durch das Gel als große. Restriktionsverdau bei uns Die Plasmid-DNA “Pfn2-9.3-gen” wird mit folgenden Restriktionsenzymen verdaut: BamHI – HindIII - BamHI und HindIII (Doppelverdau)

Dann Kartierung der Restriktionsschnittstellen für BamHI & HindIII auf dem Plasmid Pfn2-9.3-gen: für BamHI und HindIII gibt es je 2 Schnittstellen auf dem Insert.

-Schnittstelle

BamHI

HindII HindII

Experiment 2: Genomic Fingerprinting über PCR von Alu-Repeats Genomic Fingerprinting: Unterscheidung von genetischen Variationen (Polymorphismen) zur Identifikation eines Individuums Genetische Variationen bei: • •

STRs, VNTRs, … Alu-Repeats

Alu-Repeat-Analyse an Mundschleimhaut-DNA Alu-Sequenzen 

kommen im Genom von Primaten vor (dabei an versch. Loci – u.a. TPA 25 & ACE).



300bp lang



SINEs (short interspersed elements= kurze, verteilte Elemente), können durch



Retrotransposition mobilisiert werden sind Retrotransposons (bauchen LINEs zur Transposition)



haben Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Alu



gehören zu der größten Familie von repetitiven Sequenzen im menschlichen Genom



13% des menschlichen Genoms besteht aus Alu-Sequenzen (>1 Mio. Alu-Sequenzen),...