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Grundlagen der Genetik – Prof. Korff 1. Allgemeine Vererbungsregeln bei Modellorganismen Genetik befasst sich mit der Vielfalt, Vererbung, Veränderung und Umsetzung genetischer Information. A) Variation - Grundlage der Entstehung und Evolution von Arten - Ursachen von Variation: * Genotyp (Gesamtheit aller Gene eines Organismus) * Umwelt * Interaktion zwischen Genotyp und Umwelt (Aussehen eines Genotyps hängt von Umwelt ab) -> Phänotyp: Erscheinungsbild -> Gesamtheit aller Merkmale eines Organismus (Genotyp + Umwelt) => geprägt durch G und U - Interaktion zw. Genotyp und Umwelt => Gesamtheit eines Genotyp nimmt in best. Umwelt eine best. Gestalt an - gleiche Bedingungen, trotzdem Variation, dann ist es genetischer Herkunft - Genotyp*Umwelt Variation * Cross-over Interaktion: Der Effekt eines Genotyps auf den Phänotyp hängt von der Umwelt ab * Drosophila-Augen: bei Wildtyp größer; bei Mutanten ist Größe der Augen stark abhängig von der Temperatur (also von G und U) => Veränderung des Erbguts immer zufällig (Mutationsrate immer versch.) - Variation durch Mutation * Variation durch zufällige Veränderung des Erbguts * Organismen mit größerem Genom haben auch größere Mutationsraten B) VERERBUNGSGESETZE Gregor Johann Mendel (1822-1884) – Experimente an Gartenbohne - reinerbig -> 2 Chromosomen – 2 Kopien eines Genes und diese sind identisch - Mendelsche Regeln: 1. Das Uniformitätsgesetz/Einheitsgesetz Kreuzt man reinerbige (homozygot) Individuen, die in einem Merkmal unterschiedlich sind, dann sind alle Nachkommen der F1 –Generation in diesem Merkmal gleich. => man muss auf den dominanten Genotyp achten => kreuzt man diese Nachkommen, findet man Merkmale beider Eltern wieder 2. Das Spaltungsgesetz Kreuzt man die F1–Generation unter sich, dann sind die Individuen der F2 – Generation nicht mehr gleich, sondern spalten sich nach bestimmten Zahlenverhältnissen (3:1) auf. => Dabei kommen die Merkmale der P-Generation wieder zum Vorschein. 3. Das Gesetz der freien Kombination der Gene und der Erbanlagen Kreuzt man Individuen die sich in 2 Merkmalen reinerbig unterscheiden, so werden die Merkmale unabhängig voneinander vererbt. In der F2 – Generation können reinerbige Neukombinationen auftreten. - Dihybrider Erbgang: * Fellfarbe wird durch 2 Gene anstatt 1 Gen vermittelt 1

-> 1. Kaninchen hat Mutation auf Lokus A – 2. auf Lokus B -> Wildkaninchenfellgen ist dominant also bildet es auf -> an jedem der 2 Gene haben Nachkommen wildtypisches Allel von Eltern erhalten => in F2 bilden sich 4 Farben aus -> unabhängige Verteilung von Allelen eines Gens mit Allelen eines anderen => führt zu Rekombination - 2 Genotypen sind gleichwertig => intermediärer Erbgang C) MITOSE UND MEIOSE Theodor Boveri (1862-1915) – Beobachtung Meiose & Chromosomentheorie - Chromosomen sind Träger der genetischen Information - Paar (diploid) -> homologe Chromosomen * homolog bedeutet hier nur, dass es dasselbe Gen ist aber es anders aussieht => unterschiedliche Allele -> das homologe Gene gleich sind ist sehr selten - Neukombination von Genen durch sexuelle Fortpflanzung - Chromosomenanzahl: * Gartenerbse – 14 * Kartoffelpflanze – 48 * Küchenzwiebel – 16 * Honigbiene – 16 Wie wird genetische Information vervielfältigt und weitergegeben? * von Zelle zu Zelle -> Mitose * von Generation zu Generation -> Meiose MITOSE: - 2 Chromosomensätze => 1 mütterlichen + 1 - Jedes Chromosom hat 1 DNA-Molekül - DNA beider Sätze vor Teilung redupiziert = 2C nachher 2n = 4C

väterlichen = 1 Chromatide = 1C => vorher 2n = 2C

=>

- Zellteilung = Mitose => Chromatiden trennen sich - indirekte Kernteilung (ungeschlechtliche Teilung) - Zellkern enthält Chromatinkörnchen, aus denen sich bei der Mitose kleine Fädchen bilden -> Fädchen = Chromosomen - in 4 Stadien einteilbar - Chromatin 10-30 nm lang

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Ablauf Mitose:

=> Mikrotubuli bewegen die Chromosomen => Spindelapparat sorgt für gleiche Verteilung der Schwester chromatiden

=> Spindelfasern verbinden Spindelpole (Zentrosomen) mit den Kinetochoren, die an den Zentromeren der Chromosomen ausgebildet sind

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Allele:

Wichtige genetische Begriffe: Gene: Einheit der genetische Information; ein Abschnitt auf der DNA eines Chromosoms kodiert für ein Protein Genome: die Gesamtheit aller Gene und genetischer Informationen eines Organismus Allel: Allele sind Zustandsformen von Genen die durch Mutation ineinander übergeführt werden können, * befinden sich auf gleicher Position auf homologen Chromosomen * beeinflussen dasselbe Merkmal Locus: eine fixe Position auf einem DNA-Strang wo sich ein Gen/Allel befindet Zellzyklus: Cyclin-abhängige Kinasen regulieren den Zellzyklus und seine Richtung * 4 Haupteinheiten -> beginnt bei G1, S, G2, M * wenn bei Zellzyklus was falsch läuft, dann kann Apoptose eingeleitet werden DNA ist in Nucleosomen verpackt -> Histon bindet und kompaktiert das Chromatinfilament (durch Wechselwirkung der Histonschwänze) MEIOSE: trennt homologe Chromosomensätze (Vater-Allele von den Mutter-Allelen - macht aus diploiden Zellen (2n) haploide Zellen (n)

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Meiose 1:

Die Phasen der Prophase 1: - Synapse: Interphase, Leptotän - Synaptonemaler Komplex: Zygotän, Pachytän, Anfang Diplotän - Desynapse: Ende Diplotän, Diakinese Neukombination des elterlichen Erbguts: - Zufällige Verteilung der homologen Chromosomen (2^23 versch. Gameten bei Mensch) - Crossing over -> ca. 2 bis 3 crossing over/Chromosom (Mensch)

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Zusammenfassung: - 1 diploide Zelle zu vier haploiden, genetisch versch. Zellen/Gameten - 1 m. Teilung: * homologe Chromosomen werden getrennt * Reduktionsteilung * es kommt zu cross-over Ereignissen zw. homologen Chromosomen -> keine klare Trennung von mütterl. und väterl. Chromosomen - 2 m. Teilung: * Chromatiden werden getrennt Ploidiegrad (n) und DNA-Gehalt (c)

Unterschiede:

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D) MUTANTEN Thomas Hunt Morgan -> Drosophila Mutanten - wildtype, white, yellow, curly, ebony

Monohybrider Erbgang: - Merkmal von einem Gen => Erbgang eines Gen Uniformitätsregel: Kreuzt man zwei reinerbige Individuen miteinander, so sind die Nachkommen der ersten Filialgeneration uniform (auf Dominanz achten)

Spaltungsgesetz: Kreuzungen der heterozygoten Nachkommen zweier reinrassiger Elternlinien untereinander führen zur Aufspaltung der Phänotypen nach bestimmten Zahlenverhältnissen (3:1)

Wie erkennt man den Genotyp der Individien (e+/e & e+/e+)? - Testkreuzung man kreuzt ein Tier, dessen Genotyp ermittelt werden soll, mit einem Tier, das das jeweils rezessive Allel homozygot trägt

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Rekombination: Jeder Vorgang in einer Meiocyte, der zur Bildung haploider Meioseprodukte führt, deren Genotyp sich vom Genotyp der haploiden Meioseprodukte der beiden Eltern unterscheidet. Dihybrider Erbgang:

Allelpaare auf versch. Chromosomen: maximal 50% rekombinante Gameten

Punnett’sches Viereck:

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Dihybriger Erbgang gekoppelter Gene: Uniformitätsregel: kreuzt man zwei reinerbige (homozygote) Individuen, die sich in einem oder mehreren Merkmalen unterscheiden, miteinander, so sind alle Nachkommen (F1) untereinander gleich => auch bei reziproken Kreuzungen

Spaltungsregel: Kreuzungen der heterozygoten Nachkommen zweier reinrassiger Eltern untereinander führen zur Aufspaltung der Phänotypen nach festen Zahlenverhältnissen

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2. Studium der Vererbung beim Menschen A) MORGAN: GENE ALS TRÄGER DER ERBINFORMATION LIEGEN AUF DEN CHROMOSOMEN IN REIHE Thomas Hunt Morgan: - Drosophila als Modellorganismus: * leichte und billige Züchtung * Kurze Generationszeit (9-14 Tage) * Viele Nachkommen * nur 4 Chromosomenpaare Multiple Allelie:

Identische Phänotypen können durch Mutationen in verschiedenen Genen hervorgerufen werden

B) REKOMBINATION Jeder Vorgang in einer Meiocyte, der zur Bildung haploider Meioseprodukte fhrt, deren Genotyp sich vom Genotyp der haploiden Meioseprodukte der beiden Eltern unterscheidet Vorteile von Rekombination: - Größere Variation in den Nachkommen: Neue Allelekombinationen * durch zufällige Verteilung der Elternchromosomen auf die Gameten * Befruchtung: Genkombination von 2 versch. Individuen - Selektion kann best. negative Allele von der Population entfernen ohne ein ganzes Chromosom zu entfernen - Sexuelle Mechanismen, Rekombination wird für die Reparatur von DNA genutzt - ein Chromosom wird zum Templat (DNA die bei PCR vervielfältigt wird)

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Rekombinante Meioseprodukte unterscheiden sich von den parentalen Meioseprodukte in ihrer Allelkombinantion: ->

Genotyp der Meioseprodukte lässt sich durch eine Testkreuzung ermitteln => wenn die Testkreuzung eines Dihybriden ein Verhältnis der Phänotypen von 1:1:1:1 ergibt, und die Selbstung (Herstellung von Inzuchtlinien) der Dihybriden ein Verhältnis von 9:3:3:1 ergibt, so spricht das für eine unabhängige Aufspaltung der Allelpaare Testkreuzung eines dihybriden F1-Individuums: - Erwartung 1:1:1:1 Verhältnis - 1:1 Verhältnis parentaler Phänotypen und 1:1 Verhältnis mutanter Phänotypen beobachtet !! => gekoppelte Gene segregieren nicht unabhängig Rekombinante Phänotypen treten auf: - durch zufällige Verteilung der elterlichen Chromosomen - durch Crossing-over - durch Kombination von mütterlichen und väterlichen Erbgut Was zeigt Rekombinationsfrequenz an? - relative Anordnung der Gene auf den Chromosomen (cM) - Keine Information über absolute Genposition

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B.1) CROSS OVER - Überkreuzung zweier Nicht-Schwesterchromatiden von gepaarten Chromosomen => rekombinante Chromosomen

- Häufigkeit rekombinanter Elternmerkmale abhängig von der Lage der Gene auf dem Chromosom

Rekombination gekoppelter Gene durch Crossing-over:

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Rekombinante Genotypen treten seltener auf als parentale Genotypen:

=> die Häufigkeit, mit der Rekombination zwischen Genen auftritt, kann als Maß für ihren Abstand auf dem Chromosom betrachtet werden. => die Wahrscheinlichkeit eines Crossovers steigt mit der Entfernung zwischen zwei Genen => Rekombinationshäufigkeit von 1% = 1 centi-Morgan (cM) oder 1 Morgan-Einheit (ME) => Crossover führt zum Austausch von Chromosomen-Bereichen zw NichtSchwester-Chromatiden => kann auch während der Mitose somatischer Zellen auftreten -> Zufällige Paarung homologer Chromosomen in diploiden Zellen -> mitotisches Crossover führt zur Bildung homozygoter mutanter Zellklone in somatischen Geweben

CHI-QUADRAT TEST: Nullhypothese: „Die beobachteten Messwerte entsprechen den Erwartungen“  Nullhypothese: „Die beobachteten Zahlen entsprechen einer 1:1:1:1 Aufspaltung“  x^2 hier 3,43  3 DF  Mehr als 20% vergleichbare Abweichungen => Hypothese wird nicht abgelehnt

Chi-Quadrat Test: 13

 ∑

(𝑏𝑒𝑜𝑏𝑎𝑐ℎ𝑡𝑒𝑡𝑒 𝐻ä𝑢𝑓𝑖𝑔𝑘𝑒𝑖𝑡−𝑒𝑟𝑤𝑎𝑟𝑡𝑒𝑡𝑒 𝐻ä𝑢𝑓𝑖𝑔𝑘𝑒𝑖𝑡)2 𝑒𝑟𝑤𝑎𝑟𝑡𝑒𝑡𝑒 𝐻ä𝑢𝑓𝑖𝑔𝑘𝑒𝑖𝑡

 Je größer die Abweichung von der Erwartung ist, um so größer wird der x^2 Wert  Bei n phänotypischen Klassen gibt es n-1 Freiheitsgrade (DF)  In Tabelle Wert bei DF suchen und schauen wie viel % es vergleichbare Abweichungen es gibt => 0,05 Grenze beachten (darunter wird abgelehnt)

B.2) GENKARTIERUNG Die Rekombinationshäufigkeit zwischen versch. Genen kann zur Erstellung von Genkarten verwendet werden

Genkarte für Dreifaktorkreuzung zw. v, cv, ct:

Warum ist die Summe der Abstände zwischen v und ct un ct und cv nicht gleich dem Abstand zwischen v und cv? => bei Ermittlung der korrekten Genabstände der beiden äußeren Gene müssen Doppel-Crossover doppelt gezählt werden

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Berechnung der Wahrscheinlichkeit eines Doppel-Crossovers zw. v und cv ohne Interferenz:

Berechnung der Interferenz für Doppel-Crossover zw. v und cv:

Doppel-Crossover: Das Auftreten eines Crossovers kann das Auftreten eines weiteren Crossovers in der Nähe beeinflussen → Interferenz

=> Genkarten lassen sich durch rel. Häufigkeit und Verteilung von Phänotypen in Nachkommengenerationen erstellen => Die meiotische und die physikalische Genkarte sind kolinear, aber Genabstände nicht proprotional

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C) DIHYBRIDER ERBGANG - Unabhängige Verteilung paternaler und maternaler Chromosomen in der Meiose führt zu Rekombination (dihybrider Erbgang) Unabhängige Verteilung: Anzahl der Kombinationen: 2^n -> Metaphase 1 -> Metaphase 2 -> Gameten

In Menschen: e.g. 23 Chromosomen haploid 2n = 46 ; n= 23 2^n = 2^23 = ~ 8 Millionen mögliche Kombinationen => 8 Millionen mögl. Komb. der Mutter + 8 Millionen mögl. Komb. des Vaters = >64 Billionen Kombinationen für eine diploide Zygote

DIHYBRIDER ERBGANG GEKOPPELTER GENE (Alfred Sturtevant):

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D) KOMPLEMENTATIONSTESTS Sind zwei Mutationen Allele desselben Gens?

Komplementationstests zeigen, ob mutante Phänotypen durch die selben oder versch. Gene kodiert sin

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3. Abweichungen, Sonderfälle, Ergänzungen A) GESCHLECHTSGEBUNDENER ERBGANG

Autosomen und Geschlechtschromosomen: - Drosophila Weibchen -> X:A=1 - Drosophila Männchen -> X:A=0,5 Genotypen und Phänotypen geschlechtsgebundener Mutationen

X-chromosomal gebundener Erbgang: Bsp. Yellow:

Reziproke Kreuzung: => Ergibt die reziproke Kreuzung eines monohybriden Erbgangs ein anderes Ergebnis als die Ausgangskreuzung, dann handelt es sich meistens um ein geschlechtsgebundenen Erbgang 18

Ausnahmetiere:

A.1) NON-DISJUNCTION WÄHREND DER MEIOSE Ausnahmen lassen sich durch non-disjunction in der Meiose erklären

=> Primäre non-disjunction entsteht durch einen Fehler in der Segregation von homologen Chromosomen in der ersten meiotischen Teilung => Sekundäre non-disjunction entsteht während der Meiose durch einen Fehler in der Trennung der Chromatiden Non-disjunction während der Meiose:

 Ausnahmen in der Verteilung von Phänotypen im monohybriden Erbgang können durch non-disjunction in der Meiose entstehen  Primäre non-dis.: Fehler in der Meiose I (Chromosomen trennen sich nicht) 19

 Sekundäre non-dis.: Fehler in der Meiose II (Chromatiden trennen sich nicht) B) STAMMBAUMANALYSE Kreis: weiblich, Quadrat: männlich farbig: “Merkmalsträger“, zeigt den Phänotyp

Vererbung einer autosomal rezessiven Mutation:

Beispiele für rezessiv autosomale Erbkrankheiten beim Menschen: - Tay-Sachs-Syndrom - Cystische Fibrosee - Oculocutaner Albinismus => meist Enzymdefekt in einer Tyrosinase => blasse unpigmentierte Haut => oculärer Albinismus: nur Pigmentbildung in den Augen betroffen - Phenylketonurie - Albinismus => Enzymatischer Defekt, Melanin kann nicht gebildet werden => Funktionsverlustmutante 20

Risikoberechnung: Bsp. Tay-Sachs:

Vererbung einer autosomal dominanten Mutation:

Beispiel für dominant vererbte Erbkrankheiten: - Achondroplasie => Wachstumszone der langen Skelettknochen ist aktiv bis etwa 18 Jahre => Funktionsgewinnmutation => homozygot letal, da dann auch das Wachstum anderer Knochen stark betroffen ist

Vererbung eines Dimorphismus:

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HETEROSOMALE ERBKRANKHEITEN Vererbung einer X-gekoppelten, rezessiven Erbkrankeit:

- Hämophillie A (Bluterkrankung) => Fehlende Synthese des Blutgerinnungsfaktors VIII - Farbenblindheit => Ungleiches oder illegitimes Crossover -> Amplifikation und Deletion von Genen oder Genfragmenten

X-gekoppelte, dominante Erbkrankheiten:

Wichtige Begriffe: - Penetranz ist der Anteil an Individuen gleichen Phänotys, die einen best. Phänotyp ausprägen - Expressivität ist die Stärke der Ausprägung eines Phänotyps in Bezug auf ein best. Allel

C) HUMANE KRANKHEITEN - Genetisch bedingte Stoffwechselkrankheiten können letal sein - Kretinismus: Die Schilddrüse produziert zu wenig Thyroxin. => Verlangsamter Stoffwechsel, Missbildung des Skeletts, Sprachstörung, Schwerhörigkeit, evtl. Taubheit

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4. Rekombination, Genkarten, molekulare Marker A) HETEROSOMALER ERBKRANKHEITEN Chromosomale Aberrationen erzeugen Krankheiten: - autosomale Aneuploidien sind letal (außer Trisomie 13,18,21) - heterosomale Aneuploidien: => Turner Syndrom (Monosomie X) - Sterilität, geringe Körpergröße, eingeschränkte kogn. Fähigkeiten => Klinefelter Syndrom (Trisomie XXY) - Spermatogenese gestört, steril, mentale Retardation - Häufigkeit nimmt mit Alter der Mutter zu (wie bei Turner) - Down Syndrom => veränderte Augenform, mentale Retardation, verzögerte Skelettentwicklung => ohne Therapie ab 9 Jahren letal => je älter die Mutter desto wahrscheinlicher wird Down Syndrom Kind -> auch abhängig vom Alter des Vaters Reziproke Translokationen: - häufig balanciert, weil das ganze Erbmaterial da ist - Probleme bei Gametenbildung/Paarung homologer Chromosomen - führen zu Krankheiten => Proto-Onkogene werden durch Translokationsereignisse in Onkogene umgewandelt

Robertson`sche Translokation: Verschmelzung der Zentromerregion von Chromosom 21 mit Chromsom 14 -> falls unbalanciert: Down Syndrom!

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B) GENKARTIERUNG Kartierung von Genen und Mutationen beim Menschen: Ziele: - Identifikation von Genen, die in mutierter Form Krankheiten verursachen oder für best. Phänotypen verantwortlich sind - Schnelle Diagnose genetischer Risikofaktoren zur Vorbeugung vor Krankheiten oder zur gezielten Therapie Marker: - Marker werden zur Kartierung (Lokalisation im Genom) und Identifikation von Genen genutzt - Markerklassen: morphologisch, genetisch, chromosomal, biochemisch - Biochemische Marker => versch. Formen eines Enzyms, katalysieren dieselbe Reaktion, Proteinchemie, Enzymkinetik => Nachteile: Stark von Umwelt beeinflusst, Entwicklungsabhängig, Repräsentiert weniger als 10% eines Genoms - Chromosomale Marker => Strukturelle und numerische Chromosomenvariation -> Strukturell: Deletionen, Insertionen etc. -> Numerisch: Trisomie, Monosomie, Nullysomie => Nachteil: Geringe Polymorphierate - Marker Funktionen: => Als Marker (molekularer Marker) bezeichnet man eindeutig identifizierbare, kurze DNA-Abschnitte, deren Ort im Genom bekannt ist => Polymorphismus, Sequenzvariation, Genvarianten (Allele) => Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) -> Häufigste Sequenzvariation synonym – nicht synonym => Strukturvarianten -> ganze Gene dupliziert oder deletiert Molekulare Marker: Eigenschaften - Co-dominante Expression - Nicht-destruktiver Assay - Vollkommene Penetranz - Unabhängig von Entwicklung - hohe Polymorphierate - Zufällige Verteilung über das Genom hinweg Die molekulare Basis aller Marker sind Punktmutationen, „Single Nucleotide Polymorphisms“ (SNPs), Insertionen/Deletionen (InDels) oder Inversionen, durch die sich natürliche Allele voneinander unterscheiden. - SNPs können auch als molekulare Marker zur Kartierung von Genen verwendet werden - SNPs sind meist genutzte Marker für Genotypisierungsstudien - Methoden zum Genotypisieren von SNPs => Hybridisierung, Primer extension, Allel-spez. PCR, Ligation, Restriktionsverdau Restriktionsenzyme schneiden spez. (oft palindromische) Erkennungssequenzen: - palindromisch = GAATTC zu CTTAAG - Restriktionsfragmentlänge-Polymorphismen (RFLPs) können als molekulare Marker Kartierung von Genen verwendet werden => Nachweis von RFLPs durch PCR und Gelelektrophorese 24

Simple Sequence Length Polymorphism (SSLPs): - 2 Klassen => Minisatelliten - VNTRs (Wiederholungseinheit bis zu 25 bp, oft in Telomernähe) => Mikrosatelliten – STRs (Wdh.einheit kleiner als 13 bp, gleichmäßig im Genom verteilt) -> gehen als molekulare Marker -VNTRs -> sehr robust und reproduzierbar, Assays können gut automatisiert werden, hoch variable -> Nachteil: Sequenzinformation benötigt, Single-Locus Methoden zur Genotypisierung: - Traditionelle Markersysteme - SNPs Wichtigste methodische Schritte für die Hochdurchsatz-SNP-Genotypisierung: 1. Immobilisierung von DNA auf einer Matrix 2. Ligation von universellen Primerbindungstellen für parallele PCR im Hochdruchsatz 3. Auswe...