Protocolo- Hematologia I y II PDF

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protocolo de fisiología animal práctica de hematología...

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DETERMINACIÓN DE ÍNDICES HEMATOLÓGICOS La determinación de índices hematológicos proporciona información acerca de la costancia de uno de los compartimentos líquidos del organismo, la sangre. En esta sesión práctica se llevará a cabo un recuento de células sanguíneas, eritrocitos y leucocitos, se determinará el volumen de células empaquetadas o Hematocrito (Hcto), la cantidad de Hemoglobina, la fragilidad globular y se determinará la fórmula leucocitaria. Los resultados obtenidos en el recuento de eritrocitos, hematocrito y cantidad de hemoglobina se utilizarán para determinar otros índices hematológicos: volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM). RECUENTOS GLOBULARES La técnica consta de tres tiempos: a) Dilución de la sangre en líquido apropiado. b) Depositar una muestra de la dilución en una cámara especial de volumen conocido. c) Referir la cifra obtenida a la unidad de volumen adoptada, el mm3. Para realizar la dilución de la sangre son necesarias unas pipetas especiales que constan de una parte tubular calibrada y de un bulbo o cámara de mezcla con una perlita de vidrio en su interior para facilitar la dispersión uniforme de las células en el diluyente. La parte calibrada se divide en 10 partes iguales cuyo total es una unidad . En el lado opuesto del bulbo aparece el número 11 en la pipeta para glóbulos blancos y el número 101 en la de glóbulos rojos. El diluyente utilizado será diferente dependiendo del tipo de célula sobre la que se realizará el recuento. Para el recuento de ERITROCITOS se utilizará el suero fisiológico (8,5 a 9 gr en 1000 cc de agua destilada) y para el recuento de LEUCOCITOS el diluyente será el líquido de Turck (ácido acético glacial 3 ml, agua destilada 300 ml, solución alcoholica al 1% de violeta de genciana 2,5 ml).

Una vez realizada la dilución se colocará una muestra de la misma en una cámara especial. Los modelos más utilizados son los de Burker, Neubauer y Thoma. La cámara de Thoma, que será la utilizada en esta práctica, es un cuadrado de 1 mm de lado y 0,1 mm de profundidad, dividido por la intersección de líneas horizontales y verticales en 400 cuadraditos elementales. Unas líneas de referencia (longitudinales y transversales) cruzan el centro de cada serie de 5 cuadraditos elementales, dividiendo la superficie de la cámara en 16 cuadrados grandes que contienen a su vez 16 cuadrados pequeños. Esta división en cuadrados facilitará el recuento de células. Sobre la cámara se coloca un cubre especial (relativamente más grueso y de caras más paralelas) y mediante la pipeta diluidora se deposita una pequeña gota de la dilución de sangre, bien homogeneizada por agitación, en uno de los bordes del cubre de manera que el líquido se 1

extienda por capilaridad hacia la depresión donde se halla gravada la cuadrícula. El exceso de líquido pasa a los canales que rodean la plataforma en que se halla grabada la cuadrícula. El microscopio se dispone con la platina horizontal. Para centrar la cuadrícula se utiliza el objetivo débil seco (10 x), sustituyéndolo después por el fuerte seco (40 x) para poder observar las células con detalle. Es fundamental la iluminación débil, que se consigue bajando el condensador. RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS Las pipetas específicas para recuento de glóbulos rojos se llenan de sangre hasta la división 0.5 (dilución 1/200) ó hasta la división 1 (dilución 1/100) y se completa con suero fisiológico hasta la división 101. Hecho ésto, se agita la dilución contenida en la cámara de la pipeta suavemente, se desprecian las primeras gotas y se deposita una gota en el borde del cubre que tapa la cámara. Por capilaridad el líquido se extiende hasta la cámara y se espera que sedimenten los glóbulos. Se lleva la cámara al microscopio y se cuentan los glóbulos que están depositados en los cuadraditos pequeños del retículo de la misma. Cálculos: X cuadraditos ------ A eritrocitos Y= (400 x A)/ X 400 cuadraditos ------ Y eritocitos Si

0.1 mm3 ---------- Y eritrocitos 1 mm3 ---------- Z eritrocitos

Z= Y/ 0.1 = Y x 10

Z representa el número de eritrocitos en la sangre diluida. Este valor habrá de multiplicarse por 100 o por 200 en función de la dilución utilizada (diluciones al 1/100 ó 1/200 respectivamente). En resumen: 400 x A Nº eritrocitos / mm3 = --------------------- x 10 x { factor de dilución} X RESULTADOS: RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS Se utilizan las pipetas correspondientes para glóbulos blancos llenando de sangre hasta las divisiones 0.5 (dilución 1/20) ó 1 (dilución 1/10) y completando con líquido de Turck hasta la división 11. A continuación se procede igual que para eritrocitos. A la hora de hacer el recuento lo apropiado es contar todos los leucocitos que se encuentran depositados en la cámara. Para ello, se utiliza el objetivo 10 X y los cálculos se traducen en : Nº leucocitos / mm3 = B x 10 x {factor dilución} B = nº de leucocitos en toda la cámara (en 400 cuadraditos con unn volumen de 0.1 mm3)

10 = factor de transformación en mm3 Factor de dilución = 10 ó 20

RESULTADOS:

HEMATOCRITO (Volumen de células empaquetadas)

Cuando la sangre se coloca en un tubo y es centrifugada, las células rojas se depositan en el fondo empaquetadas, ya que son más pesadas que el plasma. El volumen ocupado por las células se mide y se calcula su proporción en relación al volumen de sangre total. Material: Tubos capilares heparinizados, plastilina, centrífuga de microhematocrito, lector de hematocrito. Procedimiento: La sangre se recoge mediante pipetas capilares heparinizadas, dejando al menos 15 mm sin rellenar, y taponando posteriormente los dos extremos mediante plastilina. Las pipetas son entonces centrifugadas durante 5 minutos a 3000 rpm. La centrifugación pone de manifiesto varias capas: la superior de plasma, a continuación una delgada película de color blanco (0.5 a 1 mm) que está formada por plaquetas (arriba) y glóbulos blanco (abajo), y finalmente se observa una fracción de color rojo integrada por eritrocitos. El hematocrito (Hcto) ó volumen de células empaquetadas se lee en tanto por ciento, directamente sobre el lector de hematocrito. RESULTADOS: DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA La medida de la cantidad de hemoglobina se hace posible gracias a las propiedades de la misma: a) capacidad para combinarse con el oxígeno; b) presencia de una cantidad definida de hierro en cada molécula de hemoglobina; y c) propiedades refringentes de la solución de Hb para determinadas longitudes de onda de la luz dando bandas de absorción típicas. En esta sesión práctica utilizaremos la última propiedad que nos proporcionará una estimación directa de la cantidad de Hb en sangre. ESTIMACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA: Si a través de una solución de Hb se hace pasar luz de una determinada longitud de onda, los pigmentos en solución absorberán esta luz. Utilizando luz de una longitud de onda apropiada y un espectrofotómetro podremos determinar la absorbancia de esa solución y mediante factor de transformación la cantidad de Hb presente en la misma. La longitud de onda seleccionada es de 540 nm. El método utilizado se basa en la determinación de cianmetahemoglobina (ver en sesión práctica). La transformación de los valores de absorbancia en gramos de Hb/dl se lleva a cabo multiplicando por 36.77 (A 540 x 36.77 = Hb g/dl) El intervalo de referencia es : hombre: 14 - 18 g/dl mujer : 12 -16 g/dl RESULTADOS: INDICES HEMATIMÉTRICOS Una vez determinados el nº de eritrocitos, el hematocrito y la cantidad de hemoglobina , estamos en condiciones de determinar otros índices hemáticos: - Volumen corpuscular medio (VCM) = (Hematocrito/100) / nº eritrocitos = fentolitros Ejemplo: (45 /100) / (5 millones / mm3)= 90 · 10-9 mm3 = 90 fl RESULTADOS: - Hemoglobina corpuscular media (HCM)= (Hemoglobina[gr/dl]) / nº eritrocitos [celulas/dl] = picogramos Ejemplo: 12 / 5 · 106 · 105 = 24 · 10 -12 gr = 24 pg 3

RESULTADOS: - Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) Hb (g / dl) x 100 CHCM = ------------------------------- = (g / dl) Hematocrito (ml / dl) RESULTADOS: EFECTO DE LA OSMOLARIDAD DEL MEDIO SOBRE LOS ERITROCITOS. Fragilidad globular. Diversos factores pueden alterar la permeabilidad de la membrana del eritrocito, permitiendo la salida de la hemoglobina. Este fenómeno se conoce como hemólisis. En el transcurso de la vida existe una hemólisis fisiológica en el SRE. Fuera de este lugar la hemólisis constituye un hecho patológico de orígenes muy diversos. Existe un tipo de hemólisis que viene determinada por la osmolaridad del medio. Se trata de la hemólisis osmótica y se presenta ante la acción de soluciones hipo o hiperosmóticas.La membrana del eritrocito posee una permeabilidad selectiva en virtud de la cual el agua se intercambia con rapidez. En soluciones hipertónicas, los eritrocitos ceden agua, se retraen y arrugan. Como consecuencia se altera la membrana y se produce escape de Hb. En soluciones hipotónicas los eritrocitos toman agua, se hinchan y se rompen, produciéndose la salida de la Hb. En soluciones salinas isotónicas, los eritrocitos permanecen intactos durante horas, ya que las presiones osmóticas del interior y del exterior son idénticas. La fragilidad globular puede determinarse observando la resistencia de los eritrocitos frente a soluciones de concentración salina decreciente. Material: Sangre heparinizada o citratada. Soluciones de ClNa de concentración (g/100 ml) decreciente: 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, y agua destilada. Jeringa hipodérmica con aguja fina. Procedimiento: Una vez colocadas en tubos de ensayo las soluciones salinas decrecientes (10 ml), se añaden a cada tubo 4 gotas de sangre heparinizada o citratada mediante jeringa con aguja de calibre fino, con el fin de que todas las gotas sean del mismo tamaño y no se requiera mucha cantidad de sangre. Una vez depositada la sangre en el tubo se mezcla suavemente con la solución salina sin agitar. Una vez hecho ésto, se centrifugan los tubos durante 5 minutos a 3000 r.p.m. para acelerar el proceso de sedimentación. Transcurrido dicho tiempo se observa el sobrenadante, que aparecerá teñido en aquellos tubos en los que la solución halla producido la hemólisis del eritrocito o claro en aquellos en los que todos los eritrocitos permanecen intactos y han quedado sedimentados en el fondo. La concentración de ClNa del primer tubo en el que aparece hemólisis es la que produce la rotura de los eritrocitos más frágiles, sería el punto de RESISTENCIA GLOBULAR MÍNIMA o FRAGILIDAD GLOBULAR MÁXIMA. La concentración de ClNa a la que se completa la hemólisis representa el punto en el que se rompen los eritrocitos más resistentes. Equivale a la RESISTENCIA GLOBULAR MÁXIMA o FRAGILIDAD GLOBULAR MÍNIMA. Especie Resistencia mínima Resistencia máxima Caballo 0.59 0.39 Vaca 0.59 0.42 Oveja 0.60 0.45 Cabra 0.62 0.48 Cerdo 0.74 0.45 Perro 0.46 0.33 Gato 0.69 0.50 Gallina 0.40 0.32 Estas cifras son valores medios que pueden variar dentro de las condiciones fisiológicas. 4

RESULTADOS: Resistencia mínima: Resistencia máxima: FÓRMULA LEUCOCITARIA El cuadro hemático es un complejo celular formado por células circulantes que llegan a la madurez muy diferenciadas y forman una mezcla muy constante. Estas células tienen sus precursoras inmaduras en los órganos hematopoyéticos, que tienen a su cargo la la sustitución o regeneración de las células fisiológicamente gastadas, aportando según las necesidades nuevas células. La destrucción de las células ya gastadas tiene lugar en la sangre circulante , en el bazo o en los tejidos a su paso por el SRE. La constancia se mantiene en casos normales porque los productos de la desintegración ejercen una acción estimulante sobre la neoformación. La constancia de células constituye la FORMULA LEUCOCITARIA, pudiendo ser alterada en casos patológicos. La fórmula normal en el hombre es la siguiente: Neutrófilos ............................... 60 a 65 % Eosinófilos ............................... 1 a 5 % Basófilos .................................. 0 a 1 % Linfocitos ................................. 25 a 35 % Monocitos ................................ 5 a 8 % El fundamento de la determinación de la fórmula leucocitaria consiste en teñir un frotis sanguíneo con un colorante apropiado que haga resaltar los leucocitos, realizar un recuento de un cierto número de ellos y establecer el porcentaje en que se encuentra cada uno de los distintos tipos. Material: Lancetas estériles, algodón, portaobjetos, frasco lavador, microscopio con platina de carro. Reactivos: Equipo Diff-Quik para tinción diferencial que consta de 1) Solución alcohólica fijadora 2) Solución I: colorante ácido 3) Solución II: colorante básico Procedimiento: 1. Extensión: Constituye el paso previo a la tinción y consiste en realizar una delgada película de sangre sobre un portaobjetos perfectamente limpio y desengrasado. La obtención del frotis de sangre se consigue colocando una pequeña gota de sangre en un extremo del portaobjetos, acercando a ella, hasta tocarla, otro porta de bordes esmerilados formando un ángulo de 30º con la horizontal. La gota entonces se extiende por capilaridad a lo largo de la línea de contacto de los dos portaobjetos y se realiza la extensión arrastrándola tras de si con el segundo portaobjetos. Extensiones gruesas se consiguen con un ángulo más obtuso y movimientos rápidos; más delgadas con ángulos más agudos y desplazamientos más lentos. Una vez hecha la extensión se seca al aire libre.

2. Tinción: Sujeto por un extremo se introduce el frotis sanguíneo 5 veces consecutivas en cada una de las siguientes soluciones y por el siguiente orden: 1º: solución alcoholica fijadora 5

2º: Solución ácida 3º: Solución básica Al cambiar de solución el exceso de la misma se elimina colocando el borde del portaobjetos sobre un papel de filtro. Finalmente lavar para eliminar el exceso de colorante. Secar con el papel de filtro con cuidado de no arrastrar la preparación. 3. Observación: Al microscopio con objetivo de inmersión. 4. Contaje: Cuentense 25 células en cada uno de los cuatro bordes de la preparación y anotense los resultados señalando el número de células que aparecen de cada uno de los tipos de leucocitos y expresense en tanto por ciento. RESULTADOS:

NEUTRÓFILO

NEUTRÓFILOS: EOSINÓFILOS: BASÓFILOS: LINFOCITOS: MONOCITOS:

EOSINÓFILO

BASÓFILO

LINFOCITOS GRANDES PEQUEÑOS MONOCITO

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