Przygotowanie preparatów do mikroskopii świetlnej. PDF

Preview

Summary

Wykładowca: dr hab. Małgorzata Kozieradzka-Kiszkurno, prof, UG (Katedra Cytologii i Embriologii Roślin). Punkty ECTS: 3. Spis treści: Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie świetlnym. Krojenie przygotowanych preparatów mikroskopowych. Barwienie pokrojonych preparatów. Ostatni etap przygotowa...

Description

Nowoczesne techniki badawcze w biologii i medycynie Wykład 3. Przygotowanie preparatów do mikroskopii świetlnej. 1. Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie świetlnym. Preparat badany z wykorzystaniem mikroskopu świetlnego powinien spełniać następujące warunki: • musi być odpowiednio cienki (przejrzysty), czyli posiadać maksymalnie do 20 μm; • musi byś skontrastowany (zabarwiony) w celu zróżnicowania występujących w nim struktur. Istnienie kilka rodzajów preparatów mikroskopowych sporządzanych z materiału biologicznego: • skrawki – uzyskane przez pokrojenie materiału na cienkie plasterki; • szlify – otrzymane przez zeszlifowanie tkanek twardych (zmineralizowanych) na bardzo cienkie płytki; • rozmazy – wykonywane z płynów ustrojowych (krew, płyn mózgowo-rdzeniowy), zawiesin komórkowych uzyskanych w badaniach biochemicznych, w diagnostyce histopatologicznej z materiału pobranego ze śluzówek (jama ustna, jama nosowogardłowa, pochwa) oraz z wydzielin (np. oskrzelowej); • rozgnioty – uzyskane poprzez zgniecenie komórek pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym (np. analiza chromosomów); • odciski narządowe – wykonane poprzez przekrojenie narządów lub ich fragmentów i odciśnięcie powierzchni przekroju na szkiełku podstawowym; • preparaty całościowe – położone na szkiełko całe fragmenty tkanek lub narządów (np. warstwa mięśniowa cewki pokarmowej), w których bada się przestrzenny układ włókien nerwowych lub sieci naczyniowych; • hodowle komórkowe – hodowane w odpowiednich warunkach komórki mogą osadzać się na podłożu (szkiełku podstawowym), gdzie się namnażają, tworząc pojedynczą warstwę. Materiał preparacyjny powinien charakteryzować się świeżością, jeżeli np. pochodzi od uprzednio zabitego zwierzęcia laboratoryjnego, pobieranie materiału należy wykonać jak najszybciej od chwili zgonu, a także powinien być stosunkowo niewielki. 1 Utrwalanie preparatów mikroskopowych ma na celu nagłe zatrzymanie procesów życiowych i takie ustabilizowanie struktury komórki, aby w końcowych efekcie obróbki obraz oglądany w mikroskopie pokazywał je w stanie nienaruszonym. Pozostałymi celami utrwalania są: • związanie i wytrącenie niektórych substancji rozpuszczalnych zawartych w tkankach, co zapobiega ich późniejszej dyfuzji i umożliwia uwidocznienie; • wstępne utwardzenie materiału i zwiększenie jego odporności na działanie odczynników używanych w dalszych etapach procedury. Do utrwalania materiałów biologicznych wykorzystywanych do wykonywania preparatów mikroskopowych można wykorzystać kilka rodzajów utrwalaczy: • utrwalanie chemiczne: o proste (jednoskładnikowe): § kwasy mineralne i organiczne: • chromowy; • octowy; • pikrynowy; • trójchlorowy; § aldehydy np. formalina 10% (rozkłada glikogen, nie rozkłada tłuszczy); § alkohole np. alkohol etylowy (70%), alkohol metylowy (50-100%); § ketony np. aceton (50-100%); 1

5 mm do celów mikroskopii świetlnej, 1 mm do celów mikroskopii elektronowej.

§ sole metali ciężkich np. chlorek rtęci, dwuchromian potasu; o złożone (mieszaniny dwóch lub kilku utrwalaczy prostych lub innych substancji), do najczęściej stosowanych należą: § utrwalacz Bouina – mieszanina kwasu pikrynowego, octowego oraz formaliny; § utrwalacz Susa – chlorek rtęci, chlorek sodu, kwas trójchlorooctowy, kwas octowy lodowaty, formalina oraz woda destylowana; § utrwalacz Carnoy’a – alkohol etylowy, chloroform i kwas octowy; § utrwalacz Zenkera – sublimat chloreku rtęci, dwuchromian potasu, siarczan sodu, woda destylowana, kwas octowy oraz siarczan sodu. Rozpuszczalnikiem w roztworach utrwalaczy może być woda, bufory o określonym pH i sile jonowej, a w niektórych przypadkach również alkohole. • utrwalacze fizyczne: polega na oddziaływaniu na materiał mikrofalami lub promieniowaniem jonizującym. Istnieje kilka metod utrwalania: • utrwalanie immersyjne – polega na zanurzeniu fragmentu tkanki w utrwalaczu na pewien okres obejmujący od 1 godziny do kilku dni; • utrwalanie perfuzyjne – polegające na wypreparowaniu całego narządu lub jego głównych naczyń krwionośnych, a po wytworzeniu sztucznego krążenia zamiast krwi przepływa przez łożysko naczyniowe utrwalacz; • utrwalanie przy użyciu mikrofal – materiał zanurzony w niewielkiej ilości płynu (15ml) roztworu soli fizjologicznej, buforu lub utrwalacza chemicznego, w plastikowym lub szklanym pojemniku. Każdy utrwalacz posiada grupy chemiczne aktywne, które wiążą się z określonymi grupami chemicznymi substancji obecnych w komórkach i tkankach. Większość utrwalaczy aldehydowych i związków metali powoduje powstanie tzw. wiązań krzyżowych pomiędzy grupami chemicznymi struktur komórkowych i tkankowych, czego wynikiem jest: • dodatkowe usieciowanie, czyli usztywnienie i wzmocnienie strukturalne; • zablokowanie aktywnych centrów enzymów. Duża grupa utrwalaczy, w tym alkohole i większość kwasów, to tzw. utrwalacze precypitujące powodujące denaturację i wytrącanie się białek bez tworzenia wiązań krzyżowych. W przypadku większości utrwalaczy określony jest ich maksymalny czas utrwalania. Przedłużenie tego czasu może spowodować niekorzystne zmiany strukturalne w komórkach i tkance. Proces utrwalania przerywa się poprzez wypłukanie utrwalacza z materiału przy pomocy wody lub buforu, który służył uprzednio jako rozpuszczalnik. Utrwalacze w większości trzeba poddać odwadnianiu, czyli pozbyciu się z materiału mikroskopowego wody. W procesie odwadniania zastępujemy wodę obecną w tkance alkoholem lub acetonem, a proces ten polega na przeprowadzeniu materiału przez szereg wodnych roztworów tych substancji o stopniowo rosnących stężeniach (np. 50, 70, 80, 90%). Następnym krokiem przygotowania preparatu jest dodanie płynów pośrednich, które pośredniczą pomiędzy odwadnianiem a zatapianiem w parafinie. Zatapianie jest najpopularniejszą procedurą przygotowania tkanek do rutynowych badań w mikroskopie świetlnym. Płynami pośrednimi są tutaj rozpuszczalniki organiczne jak benzen, toluen, ksylen czy chloroform. Zaletami techniki parafinowej są: • niskie koszty; • uzyskanie wystarczająco cienkich skrawków; • krótki czas trwania procedury (1-3 dni). Wadami tej techniki są jednak: • wysoka temperatura (50-60°C) powodująca inaktywację enzymów i obkurczanie tkanek; • konieczność używania rozpuszczalników organicznych powodujących wypłukiwanie z materiału tłuszczów; • konieczność dodatkowego przygotowania skrawków do barwienia;

• kruszenie i rozwarstwianie skrawków; • trudność przy krojeniu skrawków o dużej powierzchni. Następnym zabiegiem jest zatapianie w celoidynie (dwunitrocelulozie). Jest to substancja spoista i elastyczna, która zapewnia grubość skrawków na poziomie 10-20 μm. W celoidynie zatapia się materiały twarde (np. chrząstkę, odwapnioną kość), łatwo rozwarstwiające się (np. oko) lub o znacznych rozmiarach (np. całe zarodki). Innym sposobem jest zatapianie preparatów w żywicach akrylowych np. polarnych jak metakrylan glikolu (GMA) lub firmowych zestawach (np. Histo-reisin czy JB-4). 2. Krojenie przygotowanych preparatów mikroskopowych. Po uzyskaniu odpowiedniego preparatu należy go poćwiartować tak, aby można go było zaobserwować pod mikroskopem. Do tego używa się mikrotomów, szczególnie w przypadku skrawków histologicznych. Mikrotom, czyli urządzenie do krojenia skrawków histologicznych składa się z: • noża mikrotomowego; • stolika przedmiotowego; • mechanizmu skrawania; • mechanizmu regulującego grubość skrawków. Możemy wyróżnić kilka typów takich mikrotomów: • mikrotom rotacyjny – obrotowy ruch korby przekształcany jest w posuwisty, zwrotny ruch stolika względem noża; • mikrotom wahadłowy – obrotowy lub wahadłowy ruch uchwytu jest przekazywany systemem dźwignie na stolik przedmiotowy, wykonujący ruch wahadłowy; • mikrotom saneczkowy – stolik wraz z uchwytem przesuwa się ruchem posuwistozwrotnym wzdłuż prowadnic, a nóż jest nieruchomy. Noże wykorzystywane w mikrotomach mogą być zrobione z wysokogatunkowej stali lub wolframu, a w zależności od ukształtowania przeciwległych płaszczyzn noża wyróżniamy: • noże klinowe (płasko-płaskie) uniwersalnego zastosowania; • noże płasko-wklęsłe, do skrawków celoidynowych; • noże dwuwklęsłe, do skrawków parafinowych. Aby otrzymać odpowiedni preparat, należy go pokroić zgodnie z uniwersalnymi zasadami: • bloczek krojony musi mieć kształt ostrosłupa ściętego; • płaszczyzną skrawania jest prostokąt lub kwadrat • ostrze i krawędź bloczka powinny być równoległe; • krojenie powinno zachodzić szybko, w odpowiedniej temperaturze; o skrawki parafinowe (2-10 μm): § wstęga (seryjne skrawki zlepione ze sobą krawędziami); § naklejenie na szkiełko podstawowe; § powierzchnia wody; § temperatura ok. 40°C; o skrawki celoidynowe: § stałe zwilżanie noża (stali) i bloczka 70% alkoholem; § skrawki przenoszone do naczynia z alkoholem; o skrawki żywic akrylowych: § nożem z węgliku wolframu lub szklanym; § nie tworzą wstęgi; § naklejanie na szkiełko podstawowe. Przed krojeniem skrawków bloczek z zatopionym materiałem należy poddać trymowaniu, czyli usuwaniu zbędnych, niezawierających preparatu części substancji, w której zatapiany był materiał badawczy.

3. Barwienie pokrojonych preparatów. Barwienie – proces mający na celu skontrastowanie struktur komórkowych i tkankowych za pomocą zróżnicowanych barwników. Pod względem chemicznym barwniki można podzielić na różne rodzaje: • grupa barwna (decyduje o kolorze barwników); • grupę chwytną (odpowiada za wiązanie się cząsteczek barwnika z tkankowymi grupami chemicznymi); Proces barwienia polega na przyłączaniu się grup chwytnych określonego barwnika do struktur komórkowych lub tkankowych posiadających odpowiednie grupy wiążące. Skrawki z parafiny nie zabarwiają się, ponieważ cząsteczki barwnika w wodnym środowisku „odpychane” są przez parafinę. Należy usunąć parafinę np. ksylenen pod dygestorium, pozostawić skrawki na kilka godzin, a następnie nawodnić materiał przez szereg alkoholi. Skrawki celoidynowe i skrawki z żywic epoksydowych barwi się natychmiast po skrojeniu: • barwniki kwaśne – wiążą się z tymi strukturami komórkowymi i tkankowymi, które wykazują odczyn zasadowy (struktury kwasochłonne) np. białka cytoplazmatyczne, włókna kolagenowe; • barwniki zasadowe – wiążą się ze strukturami wykazującymi odczyn kwaśny (struktury zasadochłonne) np. chromatyna jądrowa (przez obecność DNA), czy rejony bogate w rybosomy. Barwienie przyżyciowe – wprowadzenie barwnika do żyjącego organizmu, do czego wykorzystuje się np. czerwień obojętną, błękit metylenowy/toluidynowy (do wybarwiania białek strukturalnych), zieleń Janusową (np. do wykrywania mitochondriów).

Rysunek 1. i 2. Wybarwione skrawki parafinowe. Ich jakość jest bardzo słaba ze względu na fakt, że najcieńszy skrawek parafinowego preparatu może mieć maksymalne od 4 do 5 μm.

Barwienie może być również procesem dwuetapowym: • tkankę poddaje się bejcowaniu tzn. działa się na nią substancją chemiczną, która sama nie kontrastuje struktur, ale jej związanie z tkanką jest konieczne do następnego przyłączenia barwnika; o za bejce służą m.in. sole żelaza, chromu i glinu (ałuny); • barwnik tworzy z bejcą tzw. lakę, czyli nierozpuszczalny i barwny kompleks Po zastosowaniu barwnika należy przeprowadzić różnicowanie, czyli traktowanie zabarwionego preparatu roztworami odbarwiającymi, które umożliwią jego oglądanie pod mikroskopem np. alkoholi, kwasów lub substancji o właściwościach utleniających. Następnie,

po zabarwieniu preparatu należy go wypłukać z barwnika, który nie został związany ze strukturami organicznymi, co można uczynić za pomocą wody lub alkoholi. 4. Ostatni etap przygotowań – zabezpieczanie preparatów. Zamykanie preparatu – zabezpieczenie preparatu przed uszkodzeniem mechanicznym, wyschnięciem, utlenieniem niektórych barwników. Polega na umieszczeniu preparatów między szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym i wypełnienie przestrzeni pomiędzy oboma szkiełkami substancją, która powinna spełniać 2 warunki: • powinna posiadać taki sam współczynnik załamania światła jak szkło; • powinna w temperaturze pokojowej hermetycznie i trwale spajać oba szkiełka. Oba warunki spełniają: o niepolarne żywice: § naturalne (balsam kanadyjski – ekstrakt z żywicy jodły balsamicznej (Abies balsamea (L.) Mill.), charakteryzujący się współczynnikiem załamania światła identycznym lub bardzo zbliżonym do wielu gatunków szkła optycznego; § syntetyczne (DPX, Malinol). Mniej trwałymi, wodnymi środowiskami zamykającymi są: • żel glicerolowy (roztwór glicerolu i żelatyny; • glicerol w soli fizjologicznej; • roztwór gumy arabskiej i sacharozy.

Rysunek 3. i 4. Pędy wraz z szyszkami jodły balsamicznej oraz balsam kanadyjski, czyli ekstrakt z jej żywicy wykorzystywany w mikroskopii.

Technika mrożeniowa – polega na utwardzeniu materiału biologicznego poprzez jego zamrożenie: • zalety: o jest krótkotrwała (kilka minut); o zachowanie wszystkich składników chemicznych – również lipidów; o przebiega w niskiej temperaturze, która zapobiega denaturacji białek, zachowuje aktywność enzymów wewnątrzkomórkowych i blokuje procesy autolityczne (histochemia i immunocytochemia); • wady: o powstają grube skrawki, które się łamią; o skrawki nie nadają się do przechowywania.

Można to wykonać dzięki zamrażaniu w ciekłych gazach (ciekły azot, freon, izopropan, ciekły hel) lub zamrażanie za pomocą zestalonego dwutlenku węgla (suchy lód). Krojenie skrawków z zamrożonego materiału w obniżonej temperaturze zachodzi z wykorzystaniem mikrotomów mrożeniowych, które są wyposażone w specjalne agregaty chłodnicze, zdolne obniżyć temperaturę noża i komory chłodniczej do -40°C. Jest to najprostsza i najbardziej niedoskonała metoda krojenia zamrożonego materiału. Wykorzystywane są w laboratoriach wykonujących rutynowo duże ilości preparatów np. pracowniach histologicznych. Krojone preparaty mają grubość skrawków 10-15 μm.

Rysunek 5. Preparat zamknięty techniką mrożeniową, oglądany następnie pod mikroskopem elektronowym....