Relazione di laboratorio - Colorazione di Gram - Microbiologia ambientale - a.a. 2015/2016 PDF

Preview

Summary

RELAZIONE DI LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA AMBIENTALE ...

Description

colorazione di Gram OBIETTIVO: colorazione di Gram di batteri derivati da suolo e osservazione microscopica STRUMENTI E MATERIALI :

STRUMENTI

VETRERIA

MATERIALI CHIMICI

Bunsen (fiamma)

Provette con coloranti

Cristal violetto

Microscopio ottico

Vetrino portaoggetti

Soluzione iodo-iodurata

Olio di immersione

Vaschetta per colorazione

Decolorante

Ansa monouso sterile

Safranina Acqua

RELAZIONE: La prova consiste nel colorare un ceppo batterico tramite la colorazione di Gram per poi poterlo osservare al microscopio ottico con l'obiettivo ad immersione.

PROCEDIMENTO: 1. prelevare con un'ansa sterile una colonia batterica da una piastra precedentemente seminata e distribuire l'inoculo su un vetrino portaoggetti dove è stata posizionata una goccia di acqua deionizzata 2. si stempera bene l'inoculo all'interno della goccia e sulla parte centrale del vetrino in modo da distribuire bene le singole cellule 3. si lascia asciugare il vetrino aiutandosi con il bunsen fino a quando non evapora tutta l'acqua. Il calore della fiamma fa in modo che il campione si fissi sul vetrino. 4. Dopo la fissazione si pone il vetrino sulla vaschetta in modo tale che esso rimanga i posizione orizzontale. 5. Si aggiunge il primo colorante sul vetrino e si lascia agire per un minuto. Il primo colorante è il cristal violetto che colora di viola; 6. dopo un minuto si elimina l'eccesso di cristal violetto con una spruzzetta con all'interno acqua deionizzata e si aggiunge la soliuzione iodo-iodurata (liquido tipo tintura di iodio) per un minuto che ha la funzione di fissare il cristal violetto ai componenti cellulari acidi e colora tutte le cellule; 7. La fase successiva è la decolorazione che consiste nell'aggiunta di una miscela 50% alcool e 50% acido acetico. Essa la si lascia applicare per 30-60 secondi fino a che il preparato non lascia più il colore. Il decolorante decolora solo i batteri gram (-) , mentre i gram (+) resistono all'azione del solvente e rimangono viola. Questo comportamento è dovuto al differente spessore dello strato di peptidoglicano; 8. dopo la decolorazione si risciacqua il vetrino con l'acqua distillata e si aggiunge il secondo colorante lasciandolo agire per un minuto. Il secondo colorante è la safranina che si lega ai componenti acidi dei gram (-) e li colora in rosso o fucsia, mentre non si possono legare ai gram (+) perchè ormai sono impegnati nel legame con il complesso cristal violetto-iodio che restano viola. 9. Ancora una volta si sciacqua il vetrino con acqua per eliminare l'eccesso di safranina e si porta ad asciugare sulla fiamma. Al termine di queste operazioni si avrà il preparato a fresco pronto per essere osservato al microscopio: 10. si inizia l'osservazione con l'obiettivo 40x in modo da individuare cellule batteriche separate e non quelle ammassate 11. una volta scelto il punto migliore, si abbassa il tavolino portaoggetti e si inserisce una goccia di olio per immersione nel punto desiderato e si passa all'osservazione con l'obiettivo 100x 12. si fa una distinzione dei tipi di batteri osservati se sono gram +, gram -, bacilli o cocchi.

CARATTERISTICHE MICROSCOPIO OTTICO:

1. Oculari : sono le lenti attraverso le quali si effettua l’osservazione. Da un lato hanno inciso un numero che rappresenta il loro fattore d’ingrandimento. 2. Obiettivo : Ciascuno microscopio ha tre o quattro obiettivi. Insieme l’obiettivo e l’oculare formano l'immagine ingrandita che viene osservata. Nella parte centrale del corpo di ciascun obiettivo è indicato il fattore d’ingrandimento. 3. Tavolino portapreparati : è il piano su cui si appoggia il vetrino da osservare; ad esso è attaccato il tavolino traslatore, che permette di spostare facilmente il vetrino in maniera controllata. 4. Condensatore : è situato sotto il tavolino portapreparati. Serve a focalizzare nel migliore modo possibile la luce sul campione ed è estremamente necessario ad alti ingrandimenti (ad esempio oltre i 400x). 5. Accensione: permette di accendere e spegnere la lampada. Regolatore luce : permette di variare l’intensità della luce. 6. Fonte luminosa: rappresenta la sorgente della luce. La lampada può essere a led o ad incandescenza. In passato la fonte luminosa era rappresentata da uno specchio. 7.Vite macrometrica: è la manopola di regolazione grossolana della messa a fuoco. 8.Vite micrometrica: più piccola della precedente; è disposta sopra quella macrometrica (coassiale con essa). Permette la regolazione fine della messa a fuoco. 9.Terzo occhio per la telecamera: permette l’inserimento di una telecamera. Come si usa 1. Preparare il vetrino 2. Posizionare il vetrino sul tavolino portaoggetti (bloccandolo con le molle ferma-vetrino). 3. Scegliere l’ l’obiettivo a minimo ingrandimento e mettere a fuoco (prima con la vita macro- e poi con quella micrometrica 4. Regolare la luce ed il condensatore. 5. Spostare il tavolino (e quindi anche il vetrino) ed osservare gli altri campi. 6. Aumentare l’ingrandimento (girando il tamburo porta obiettivi).

Possibili errori: L'identificazione batterica è una procedura molto delicata e gli errori da valutare possono essere tanti. Un errore possibile può avvenire durante la fase di decolorazione che è una fase critica perchè un eccessiva durata fa sì che i gram + appaiano come gram -, mentre una decolorazione ridotta non permette l'estrazione completa del complesso cristal violetto-iodio e fa apparire i gram – come gram + ; inoltre vanno utilizzate colture fresche di 24 ore circa poiché le cellule vecchie, soprattutto quelle dei gram +, tendono a perdere la capacità di trattenere il primo colorante per cui nello striscio si possono osservare reazioni variabili con alcune cellule colorate in viola e altre in rosso. Tuttavia l'errore più facile da commettere è quello di contaminare il vetrino. La contaminazione può avvenire nei passaggi precedenti, durante la semina della coltura. CONCLUSIONI: Dalle colorazioni e dall'osservazione microscopica si può comprendere uno degli ultimi passaggi dell'identificazione batterica,quella che consente di colorare e osservare la forma e la disposizione delle cellule oltre che di classificare i batteri in gram – e gram +. La prova non è complessa, ma bisogna fare molta attenzione nell'eseguire i vari passaggi per evitare la contaminazione. Dalla prova di laboratorio tramite la colorazione di Gram si è rilevato il batterio della Salmonella cioè dei bacilli gram negativi definiti anche anaerobi facoltativi....