Samenvatting Genetica technieken opsporen mutatie PDF

Preview

Summary

Download Samenvatting Genetica technieken opsporen mutatie PDF

Description

Mutatiedetectie hfdst 4 en 5 TK:       

Weten welke technieken beschikbaar zijn voor de bevestiging of uitsluiting van genetische aandoeningen De principes en beperkingen van de verschillende technieken kennen Voordelen van SNP array vs array CGH begrijpen Begrippen primerspecificiteit en allelic dropout begrijpen Kunnen inschatten wat de meest aangewezen techniek is afgaande op verwachte afwijking Mutaties correct kunnen benoemen/interpreteren Voordelen van NGS vs Sanger sequencing begrijpen

Cytogenetische technieken: chromosomale afwijkingen 1. Karyotypering: numerieke en structurele chromosoomafwijkingen a. Afwijkingen vanaf 5 mB (5 miljoen BP) b. Gebalanceerde afwijkingen te zien in karyogram: i. Reciproce translocatie: tss 2 niet-homologe chromosomen ii. Robertsoniaanse translocaties: fusie 2 q-armen acrocentrische chromosomen (“rob”) iii. Inversies 1. Paracentrisch: zelfde chromosoomarm (centromeer nt betrokken) 2. Pericentrisch: tss 2 armen (centromeer wel betrokken) c. Ongebalanceerde afwijkingen niet-homologe chromosomen i. Deleties: grote deleties  partiële monosomie 1. Terminaal 2. Interstitieel ii. Duplicaties: grote duplicaties  partiële trisomie iii. Marker chromosomen 1. Meestal mozaïsch 2. Bijkomende kleine, niet geïdentificeerde chromosomen iv. Ringchromosomen v. Isochromosomen: 2 maal dezelfde arm = verlies andere arm  trisomie + monosomie d. Neg: i. Resolutie is beperkt, enkel chromosomen zichtbaar (niet kleiner dan 5 mB) ii. Arbeidsintensief iii. Duurt heel lang (cellen kweken…) e. Pos: i. Heel genoom in kaart brengen 2. FISH: deletie, duplicatie, herranschikking a. Vanaf 300 kB b. Fluorescente in situ hybridisatie i. Gebruik van probes 1. Gen/locusspecifieke probes: specifiek gen/regio  deletie en duplicatie 2. Repetitieve DNA probes: satellietDNA of repetitieve elementen: centromeren, telomeren, heterochromatineregio’s  vnl aantal kopieën chromosoom bepalen door hybridisatie centromeer 3. Paint probes: mix v probes om heel chromosoom aan te kleuren  detectie chromosoomherschikking

c. Neg: i. ii. d. Pos: i. ii. iii.

Je ziet niet het hele genoom Locatie van defect moet gekend zijn

Snel (niet per se delende cellen nodig) Groot aantal cellen Zowel delende als niet delende cellen 1. Delende cellen: interfase en metafase  structurele afwijkingen, translocaties 2. Niet delende cellen: interfase  deleties, duplicaties, numerieke chromosoomafwijkingen iv. Duidelijk, betere resolutie Array technologie : opsporing copy number variations (CNV) 1) Micro-array: deleties, duplicaties, expressie a. Vanaf 100 kb a. CGH array: comparative genomic hybridisation i. DNA patiënt vgl met DNA refferentiepersoon b. SNP array: single nucleotide polymorphism :aantal kopieën en genotype i. Superveel probes ii. Bepalen kopieën en genotype 2) Microarray neg a. Geen gebalanceerde afwijkingen detecteren (winst/verlies aan materiaal) b. Te veel cellen in een keer om mozaïcisme te detecteren (cytogenetica: per individuele cel) 3) Microarray pos a. Hoge resolutie b. Snel: niet kweken, rechtstreekse extractie c. Geen locatie nodig 4) SNP beter dan CGH: a. Ook genotype  parentale oorsprong CNV vinden b. Vinden van triploïdie c. Opsporen UPD Moleculaire technieken (technieken op baseniveau): puntmutaties, zeer kleinedeleties/duplicaties 1. PCR (polymerase chain reaction): specifieke allelen, repeatexpansies a. Uit kleine hoeveelheden DNA target sequences amplificeren b. 1500 bp en minder c. Doel 1. Amplificatie bepaald fragment voor verdere analyse met een tweede techniek (bv Sanger sequentiebepaling) 2. Directe analyse geamplificeerd fragment (bv lengtebepaling, aan/afwezigheid van een bepaalde sequentie, quantificatie) d. Neg: 1. Heel gevoelig voor contaminatie 2. Maar beperkte lengte geamplificeerd fragment  long range PCR 3. Allelische dropout 4. Fouten maken bij DNAsynthese  oplossen met polymerases met proofreading activiteit e. Pos: 1. Maar kleine hoeveelheid DNA nodig 2. Hoge specificiteit f. Soorten 1. Multiplex PCR: meerdere primers  meerdere stukjes amplificeren

2.

3. 4.

5.

6.

2. Touch down PCR: beginnen bij een te hoge temperatuur voor de primers, daarna per reactie met een halve graad verlagen  verhinderd aspecifieke amplificatie 3. Hot start PCR: polymerase pas toevoegen/activeren wanneer de temperatuur al veel te hoog is  verhinderd aspecifieke amplificatie 4. Long range PCR: PCR om tot 30 kb te amplificeren 5. Repeat primed PCR: een vd 2 primers is opgebouwd uit repetitieve sequentie  sequencies onderzoeken 6. Nested PCR: amplificatie in 2 delen  tweede deel is amplificatie met primers die zich reeds in het geamplificeerd fragment bevinden 7. Real time PCR/kwantitatieve PCR: detectie en kwantificatie ve fluorescente reporter  in elke cyclus hoeveelheid fluorescentie meten  hoeveelheid startmateriaal bepalen MLPA: deleties, duplicaties a. Multiplex ligand dependent probe amplification b. Bepaling aantal kopieën v 50 DNA sequenties  heel veel tegelijkertijd Southern blotting: duplicaties, inserties, deleties, herranschikkingen Sanger sequencing a. Bepalen basenvolgorde DNA b. Neg: 1. levert maar 500-1000 bp van 1 DNAfragment 2. grotere delen = zeer duur en arbeidsintensief NGS (next generation sequencing) : puntmutaties, deleties, inserties, herranschikkingen a. Sequentie zeer grote fragmenten + sequentie zeer veel fragmenten bepalen b. Pos: in 1 reactie c. Soorten 1. Targeted sequencing: geselecteerde doelwitsequentie 2. Exome sequencing: exoom 3. Genome sequencing: compleet genoom 1. Pos: 1. Detectie herrangschikkingen  ook gebalanceerde afwijkingen 2. Neg: 1. Duur 2. Gecompliceerd 4. RNA seq: transcriptoom d. SBS: pos. : 1. zeer hoge accuraatheid 2. sequencing tot 300 bp 3. snel e. ion proton technologie pos. : 1. lage kostprijs per base 2. snel f. ion proton technologie neg: 1. niet geschikt voor bepaling homopolymeerregio’s 2. vereiste doelsequenties aan te rijken/amplificeren  onevenwichtig  volledige genome sequencing Direct sequencing: puntmutaties, kleine deleties, inserties

Proces 1. Karyotypering a. Celcultuur: delende cellen verkrijgen

b.

c.

d.

e.

f.

i. Bloedafname --> groeifactoren en mitogenen toevoegen ii. --> delende cellen Oogsten i. Metafase stoppen (toevoeging colcemide) ii. Toevoeging hypotone oplosing: cellen zwellen op --> chromosomen krijgen meer plaats om te spreiden iii. Fixatie cellen Spreiden i. Op objectglaasjes druppelen ii. Drogen Kleuring : Q-bandering 1, G-bandering2, R-bandering3 i. Verkrijgen specifiek bandenpatroon ii. Nummering banden vanaf centromeer tot telomeer, per arm Metafasen selecteren onder lichtmicroscoop i. Tellen en analyseren ii. Onderzocht door computergestuurde beeldanalyse Karyogram i. Sortering chromosomen op grootte en centromeerpositie 1. Metacentrische chromosomen: in het midden, p en q even lang 2. Submetacentrische chromosomen : p arm korter 3. Acrocentrische cromosomen: bijna geen p arm ii. Numerieke afwijkingen: chromosomen te veel: +, te weinig: iii. Structurele afwijkingen: 1. Gebalanceerd: geen netto verlies of winst aan chromosomaal DNA 2. Ongebalanceerd: netto verlies of winst

2. FISH a. Denaturatie: DNA dubele helix wordt uiteen gehaald b. Specifieke DNA probe wordt aangemaakt en gemerkt c. Hybdridisatie doelwitsequentie en probe tijdens interfase of metafase (37 graden) i. (Probe= een klein stukje DNA of RNA waarmee op basis van zijn nucleotide samenstelling door middel van hybridisatie een specifiek DNA- of RNA fragment herkend kan worden. Door de probe te labelen kan het DNA-RNA fragment gedetecteerd worden) d. Niet-specifiek gebonden probes wegwassen met buffers e. Visualisatie onder fluorescentiemicroscoop f. Analyse: i. Gezond persoon : 2 zichtbare probes binden ii. Deletie: maar 1 probe kan binden iii. Duplicatie: 3 probes zullen binden iv. Meerdere probes kunne verschillend gemerkt worden  verschillende probes simultaan aanwenden 3. CGH array a. Fluorescent merken DNA patiënt en refferentiepersoon (bv. rood en groen) b. Samen op chip plaatsen met “intensity only” probes  hybridisatie 1 Quinacrine, niet zo vaak gebruikt; fluorescentiemicroscoop nodig 2 Giemsa-bandering, vaakste gebruikt 3 Reverse bandering, tegenovergestelde patroon aan Q-en G-bandering

i.

Korte stukjes DNA uit regio’s vh genoom waarvan men het aantal kopieën wilt bepalen c. 2 DNA’s binden aan de probes  Duplicaties/deleties = rood/groen, evenveel = geel d. Per probe (positie) op de chip wordt de intensiteit vd fluorescentie bepaald  berekening hoeveelheid DNA per plaats (  log ratio) 4. SNP array a. Chip bevat enorm veel probes, vnl probes die complementair zijn aan DNA voor een bepaald ziektebeeld b. DNA wordt geamplificeerd en in fragmentjes geknipt c. Het DNA wordt op de chip uitgestreken  begint te hybridiseren met probe i. Probes zijn zo gemaakt dat ze complementair zijn aan DNA tot 1 bp voor een SNP (single nucleotide morphism) d. Elke probe wordt verlengd met een gelabelde nucleotide complementair aan SNP i. A en T: met biotine ii. G en C met dinitrofenol iii. SNP zo gekozen dat enkel AG, AC, TG of TC mgl zijn e. DNA wordt weggewassen f. Ingebouwde nucleotiden worden fluorescent gelabeld: i. Rood: Anti DNP, bindt aan dinitrofenol ii. Groen: streptavidine: bindt met biotine g. 2kleuren laser gaat er over  fluorescentie wordt feller i. Kleur: welke nucleotide is ingebouwd ii. Intensiteit: of er een deletie of duplicatie is h. Per chromosoom worden deze individuele probes gebundeld tot plots i. Elke SNP: 2 versies  AA, AB of BB 1. Uitgedrukt in B allele frequentie “BAF” = 0%,50%,100% 2. Deletie: AB valt sws weg 3. Duplicatie: nieuwe combinaties AAB, ABB = 33%,66% 5. PCR a. Algemeen i. Adhv: 1. DNA polymerase: voegt basen toe in de 5’3’ richting 2. PCR primer: engelstrengig DNA, 18-25 bp, bindt aan begin en einde van te amplificeren fragment i. 40-60% vd primer moet uit G of C bestaan + evenwicht tss primers ii. Smelttemperatuur beide primers gelijk iii. Specifiek (dus enkel thv targetsequentie) iv. Geen complementariteit tussen primeruiteinden v. Geen complementariteit tussen de PCR primers onderling. 3. dNTP = deoxynucleotidetrifosfaat ii. Alles wordt samengevoegd iii. Denaturatie: temperatuur: 90 graden  enkelstrengig DNA iv. Annealing (aanhechting) : temperatuur: 50-65 graden  hybridisatie primers aan complementaire sequentie

v. Elongatie: temperatuur: 72 graden  optimale temperatuur voor polymerase  DNA synthese vi. Herhaling van 25-30 keer b. Kwantitatief sequencing i.

TaqMan probes: 1. Fluorescente dye aan de 5' base, quenching dye aan de 3' base  De quencher verhindert fluorescente emissie. 2. Quencher en fluorescente dye samen  geen signaal 3. Taqman probes: hybdridiseren in een PCR 4. Tijdens PCR: 5’ uiteinde van de probe met de fluorescente dye wordt afgesplitst  fluorescent signaal = proportioneel met hoeveelheid DNA waar de probe op kon binden ii. Molecular beacons 1. fluorescente dye en een quenching dye aan uiteinde prove  Verhindering fluorescente emissie  scheiding tijdens PCR  fluorescent signaal 2. Verschillende fluorescente dyes voor verschillende probes  meerdere bepalingen in 1 reactie 6. MLPA a. Opgebouwd uit MLPA probes i. Specifieke DNA sequentie complementair aan DNA ii. Stuffer gedeelte: willekeurige sequentie  variabele lengtes tss verschillende probes iii. Universele primersequentie b. Per DNAfragment 2 probes die vlak naast elkaar liggen c. Probes hybridiseren  worden daarna aan elkaar geligeerd d. Multiplex PCR adhv universele primersequenties  een probecombinatie bevat in totaal 2 primers = begin en eindprimer  met 1 set primers alle aan elkaar geligeerde probes amplificeren e. Stuffersequenties zorgen voor verschillende amplificatieproducten  worden gescheiden via capillaire gelelctroforese4 f. Copy number wordt bepaald door vgl met een referentie 7. Southern blotting a. DNA in stukjes knippen b. Stukjes van elkaar scheiden door gelelectroforese c. Kleine stukjes gaan sneller naar positieve pool  gesorteerd op grootte d. Denaturatie en fixatie op een membraan e. Hybridisatie met gelabelde probe f. Detectie waar probe zich heeft gehybdridiseerd + analyse hybridisatiepatroon en intensiteit 8. Sanger sequencing a. Tijdens sequence PCR worden deoxynucleotiden en dideoxynucleotiden (gelabeled) ingebouwd

4 Gelelektroforese is een scheidingstechniek die moleculen onder invloed van een elektrisch veld laat bewegen in een gel

b. Dideoxynucleotide bevat geen OHgroep aan 3’uiteinde = noodzakelijk bij ketenaangroei  keten wordt niet meer verlengd c. Herhaling replicatie  elke keer een inbouwen  er ontstaan fragmenten die elke keer in 1 nucleotide verschillen d. Scheiden via capillaire gelelektroforese  per lengte kijken naar label 9. NGS a. Aanrijking/library prep: isolatie targetsequences i. Verschillende manieren 1. Multiplex PCR: ontwikkeling aanflankende primers en amplificatie target sequences 2. Hybridisatie: target specifieke probes met adaptorsequenties  hybridisatie met targetsequence  zitten vast op een drager, niet gehybdridiseerde sequenties worden verwijderd  sequencing 3. Sureselect: Lange RNA probes hybridiseren aan DNA  gescheiden van niet gehybridiseerd DNA adhv beads  amplificatie DNA  sequencing 4. Haloplex: gefragmenteerd DNA wordt gehybridiseerd aan target probes. Deze probes zijn zodanig ontwikkeld dat ze aan beide uiteinden van een target region hybridiseren. De gehybridiseerde targetregions worden van de niet gehydridiseerde fragmenten gescheiden door beads  amplificatie b. Inbouwen multiplex identifiers (MID) i. = korte sequentie die aan aangerijkte targetsequentie gehecht wordt  wordt mee gesequenced  adhv hiervan oorsprong bepalen ii. Alle sequenties v zelfde identiteit krijgen zelfs MID (bv. 1 patiënt)  in 1 reactie sequentie 100den patiënten tegelijk c. Sequencing i. Sequence by synthesis SBS5 1. Universele forward en reverse primer binden aan aangerijkt DNA (via adaptorfragmenten) 2. Bridge amplification via polymerase: herhaalde cycli waardoor clusters van dezelfde DNAstukjes ontstaan 3. Geamplificeerde fragmenten bevatten specifieke sequentie  binden aan primer 4. Binding 4 gemodificeerde dNTPs  slechts 1 nucleotide kan ingebouwd worden  adhv fluorescent signaal bepalen welke nucleotide werd ingebouwd  wordt verwijderd  opnieuw inbouwen  bepalen… herhalen ii. Ion Proton semiconductor technologie 1. Semiconductor chip heeft hoge densiteit aan microwells registratie biochemische processen i. Elke well bevat en verschillend DNA fragment ii. Onder de well: ion sensor iii. Inbouwen nucleotide  H+ komt vrij  pH wijziging 1. Onder de Well: ionsensor  registreert dit en geeft signaal door (enkel wanneer de nucleotide wordt ingebouwd, zoals bij SBS)  registratie DNA

5 https://www.youtube.com/watch?§v=fCd6B5HRaZ8 (illumna sequencing by synthesis)...