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CUESTIONES_Grupos Reducidos Bioquímica y Biología Molecular 2020 1.-Indique cuantos tipos diferentes de macromoléculas y cuales debe contener como mínimo un sistema sintetizador de proteínas libres de células provenientes de E. coli? Se necesita el mRNA, los ribosomas, los aminoacil-tRNA necesarios, los factores de iniciación, los factores de elongación (Ef-Tu, Ef-Ts, Ef-G, peptidil transferasa) y los factores de terminación (RF1, RF2, RF3). 2.-¿En que consiste y cual es la función biológica de la secuencia SD (Shine Dalgarno)? ¿Por qué si se añaden oligonucleótidos que contienen secuencias SD a un sistema de síntesis proteica in vitro inhiben la traducción en procariotas? ¿Por qué no se observa lo mismo en eucariotas? La secuencia Shine Dalgarno es una secuencia del ARNm de procariotas que se une al rRNA 16S, de la subunidad pequeña del ribosoma, permitiendo el inicio de la traducción. Los oligonucleótidos que contienen secuencias Shine-Dalgarno se unen al extremo 3´ del RNA 16S, por lo que compiten con las secuencias Shine-Dalgarno de las regiones de iniciación de la traducción del mRNA procariótico. Los mRNAs eucarióticos y RNAs 18S no tienen este tipo de secuencias y no son, por tanto, afectados por estos oligonucleótidos. 3.-Cuando a un extracto de células eucarióticas traduciendo activamente mRNAs endógenos se añade un análogo de la estructura “cap” (por ejemplo, m7GTP), se inhibe la traducción de la mayoría de estos mensajeros. Explique la razón de esta inhibición. Suponga que la traducción de un determinado mRNA eucariota presente en el extracto es muy resistente a esta inhibición. ¿A que puede deberse esta resistencia? Podría existir un mecanismo de regulación en estas células que hipotéticamente permitiese la traducción específica de este mRNA resistente? ¿En que consistiría? La inhibición se produce debido a que el análogo de la estructura CAP compite con el mRNA para unirse a la CBP (Cap Binding Protein). Así, al impedir la unión del mRNA a la CBP se inhibe la traducción de este. La iniciación en eucariotas puede ser dependiente de CAP o independiente, tratándose entonces del segundo caso en esta situación. La traducción de este mRNA podría deberse a la presencia de la secuencia IRES (Internal Rybosome Entry Site), que permite que algunos mRNA se unan directamente a la subunidad pequeña del ribosoma ENSAYO DE LOCALIZACIÓN CELULAR 4.-A partir de una secuencia conocida de DNA de un gen que codifica para una proteína: a) Como puedo determinar la localización celular de una proteína? Se puede determinar la localización celular de una proteína debido a la existencia en las proteínas de una secuencia de aminoácidos o péptido señal, que determina un destino final para la proteína. Podemos traducir el ADN en proteínas y luego ir a una base de datos e introducir esta secuencia de aminoácidos, buscando la secuencia señal. Luego, además, en la célula “in vivo” podemos marcar con anticuerpos la proteína y comprobar que se encuentra en el compartimento que hemos predicho previamente. b) Como puedo modificar la localización celular de la proteína? Cambiando el péptido señal de esta, mediante mutaciones.

5.-Genbux Inc., una empresa de biotecnología, clonó el gen codificador de una enzima con valor industrial en E. coli, de manera que se produce la enzima en grandes cantidades. Sin embargo, dado que la empresa desea producir la enzima en cantidades por toneladas, el gasto de aislarlo se vería muy reducido si se pudiera lograr que la bacteria la secretara. Como consultor de alto costo, ¿qué consejo general le ofrecería para solucionar este problema? Habría que añadir una secuencia señal específica de secreción en la pauta de lectura para que al segregarse la proteína se dirija al exterior de la célula.

ENSAYOS DE PLEGAMIENTO 6.-En la Figura se muestra un centro activo de interacción con un átomo de Fe determinado mediante cristalografía de Rayos X. Para conocer la participación de los aminoácidos alrededor de ese centro activo, que experimentos plantearía?

Plantearía hacer mutantes de los aminoácidos por separado y se hacen ensayos relacionados con el centro activo, para ver si son funcionales o no. 7.-Análisis de las Proteínas NLGN-3: WT y mutantes, mediante: DIGESTIÓN CONTROLADA CON TRIPSINA.

a.-Técnica utilizada para visualizar las proteínas Western Blot. b.-Anticuerpo utilizado Se utilizo el anti cuerpo NLGN3, que es un anticuerpo específico. c.-Significado de L144P Significa que hay una mutación en el aminoácido en la posición 144, donde se cambia una “L” por una “P”. d.-Muestras y tratamientos usados Las muestras utilizadas son proteínas inmuno precipitadas. Hay un WT y dos mutantes (R83H y L144P), estos se someten a un tratamiento a diferentes tiempos con y sin tripsina. e.-Resultados y Discusión

Se observa como la proteína mutante R83H se degrada y la degradación aumenta con el tiempo. El mutante L144P es más resistente a la degradación por parte de la tripsina. El tratamiento sin tripsina es para observar in existe degradación independiente de la tripsina. .-Como se puede determinar alteraciones en el plegamiento de una proteína? Se determina con las bases de datos, se compara estos datos con otras secuencias de proteínas que sean similares, se realizan mutantes, y se realizan estos ensayos para confirmarlo. .-Que causas pueden producir esas alteraciones en el plegamiento de una proteína? Se pueden producir mutaciones determinadas en la proteína a estudiar, y mal funcionamiento de las chaperonas. .-Que consecuencias se pueden producir por el mal plegamiento de una proteína? Pueden producir un mal funcionamiento de las proteínas o un fallo en el tráfico intracelular. 8.-ETAPA DE ELONGACIÓN EN PROCARIOTAS: a) Haga un ESQUEMA describiendo las diferentes reacciones que tienen lugar durante la elongación de la cadena polipeptídica, destacando el papel de los factores proteicos de elongación y del GTP. b) Elija una de las reacción anteriores y describa con detalle un experimento que permita demostrarla, indicando las técnicas a utilizar. c) Indique el papel del rRNA en cada una de las reacciones anteriores. La etapa de elongación es similar en procariotas y eucariotas, implicando en ambos casos a 3 factores de elongación. Consta de tres etapas que se repiten de forma cíclica: o Descodificación: Consiste en el reconocimiento del codón que se encuentra en el sitio A del ribosoma y está mediada por el EF-Tu, que está asociado al GTP y se regenera después de cada ciclo por acción del EF-Ts. El tRNA iniciador unido al codón AUG ocupa inmediatamente el sitio P, mientras que el sitio A adyacente permanece libre. Primero, el EF-Tu se une al GTP y al tRNA cargado; el complejo resultante entra en el sitio A del ribosoma, donde el anticodón del tRNA se aparea con el codón del mRNA y, finalmente, el GTP se hidroliza a GDP y se libera el complejo EF-Tu-GDP por la acción de EF-Ts. En eucariotas, el factor eEF-1α/GTP es equivalente a EF-Tu y es regenerado por eEF-‘1βγ+GTP. o Transpeptidación: Consiste en la transferencia del péptido en síntesis del sitio P al sitio A y se produce debido a la formación de un enlace peptídico entre el aminoácido aportado por EF-Tu y el péptido en síntesis. El grupo NH2 del aminoácido del sitio A realiza un ataque nucleofílicosobre el grupo COOH terminal del péptido del sitio P. En la síntesis de proteínas bacterianas, el rRNA 23S de la subunidad robosómica mayor cataliza esta reacción peptidiltransferasa. Es decir, este rRNA actúa como un ribozima. En eucariotas se cree que esta función la lleva a cabo el rRNA 28S. o Translocación: Consiste en el desplazamiento del ribosoma a lo largo del mRNA por una distancia equivalente a un codón, lo que provoca que el péptido en síntesis pase del sitio A al sitio P. El proceso es mediado por EF-G/GTP (eEF-2/GTP en eucariotas), que tiene una estructura similar al tRNA-EF-Tu y se conoce como translocasa, que se introduce em el sitio A, “empujando” al tRNA que se encontraba en él hacia el sitio P, de forma que el tRNA que se encontraba en el sitio P pasa al sitio E para ser eliminado (en realidad lo que se mueve es el ribosoma ya que los tRNA están unidos al mRNA por puentes de hidrógeno). La energía para el proceso procede de la hidrólisis del GTP....