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ARTÍCULO https://doi.org/10.1038/s41467-021-23448-7

ABIERTO

Un estabilizador de HIF-1α de molécula pequeña que acelera la cicatrización de heridas diabéticas Guodong Li 1,7, Chung-Nga Ko2,7, Dan Li1,7, Chao Yang Carmelo Di Primo

1234567890 ():,;

Chung-Hang Leung

1,7,

Wanhe Wang 2, Guan-Jun Yang1,

3,4, Vincent Kam Wai Wong5, Yaozu Xiang6, Ligen Lin1✉, Dik-Lung Ma2✉ y

1✉

La cicatrización deficiente de las heridas y las complicaciones de las úlceras son una de las principales causas de muerte en los pacientes diabéticos. En este estudio, reportamos el diseño y síntesis de un complejo metálico de iridio (III) ciclometalado.1a como estabilizador del factor-1α inducible por hipoxia (HIF-1α). Los análisis biofísicos y celulares in vitro demuestran que este compuesto se une a Von Hippel-Lindau (VHL) e inhibe la interacción VHL-HIF-1α. Además, el compuesto acumula niveles de HIF-1αen celulo y activa la expresión génica mediada por HIF-1α, que incluye VEGF, GLUT1, y EPO. En modelos de ratón in vivo, el compuesto acelera significativamente el cierre de heridas tanto en ratones normales como diabéticos, observándose un efecto mayor en el grupo de diabéticos. También demostramos que los genes impulsados por HIF-1α relacionados con la cicatrización de heridas (es decir,HSP-90, VEGFR-1, SDF-1, SCF, y Empate-2) aumentan en el tejido de la herida de 1a-ratones diabéticos tratados (incluidos,db / db, Modelos HFD / STZ y STZ). Nuestro estudio demuestra un estabilizador de molécula pequeña de HIF-1α como un agente terapéutico prometedor para la cicatrización de heridas y, lo que es más importante, valida la viabilidad de tratar heridas diabéticas mediante el bloqueo de la interacción VHL y HIF-1α.

1 Laboratorio Estatal Clave de Investigación de Calidad en Medicina China, Instituto de Ciencias Médicas Chinas, Universidad de Macao, Macao, China. 2 Departamento de Química,

Universidad Bautista de Hong Kong, Kowloon Tong, Hong Kong, China. 3 Laboratoire ARNA, Universidad de Burdeos, Burdeos, Francia. 4 INSERM U1212, CNRS UMR 5320, IECB, Pessac, Francia. 5 Laboratorio Estatal Clave de Investigación de Calidad en Medicina China, Universidad de Ciencia y Tecnología de Macao, Macao, China. 6 Hospital del Este de Shanghai de la Universidad de Tongji, Facultad de Ciencias de la Vida y Tecnología, Universidad de Tongji, Shanghai, China. 7Estos autores contribuyeron igualmente: Guodong Li, Chung-Nga Ko, Dan Li, Chao Yang. ✉Email: [email protected]; [email protected]; [email protected] COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | (2021) 12: 3363 | https://doi.org/10.1038/s41467-021-23448-7 | www.nature.com/naturecommunications

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ARTÍCULO

COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | https://doi.org/10.1038/s41467-021-23448-7

La cicatrización de heridas en el suelo, especialmente en pacientes diabéticos, conduce

PAG

Resultados

a una morbilidad y mortalidad considerables y puede tener un impacto socioeconómico

Detección y optimización basada en la estructura de moléculas pequeñas como

de gran alcance.1. El mercado mundial anual de productos avanzados para la

posibles estabilizadores de HIF-1α mediante el seguimiento de la actividad de

cicatrización de heridas para heridas y cicatrices difíciles de curar supera los 5 mil millones de

luciferasa impulsada por HRE. Una biblioteca de complejos metálicos

dólares.2. La cicatrización de heridas en pacientes diabéticos se ve comprometida debido a la

ciclometalados Ir (III) / Rh (III) 1-14 (como racematos) con diversas estructuras

contracción deficiente de la herida, la reducción del suministro de sangre y la infección.3-5.

fueron seleccionadas para el cribado inicial, con el fin de identificar

Hasta la fecha, se encuentran disponibles varias estrategias de tratamiento para las heridas de

subestructuras favorables para el diseño de la siguiente ronda de complejos (Fig.

la diabetes, que incluyen

1a). En las células, HIF-1α se mueve hacia el núcleo y se une a

desbridamiento regular, revascularización quirúrgica, infección, el elemento de respuesta a la hipoxia (HRE) en los promotores de la terapia, genes transactivados. En este estudio, se realizó el ensayo de descarga de presión y tejido alternativo diseñado por bioingeniería productos6-8. Sin embargo, la mayoría de los tratamientos son efectivos solo para indicador de luciferasa dual (DLR) para controlar las variaciones de la actividad de luciferasa impulsada por HRE inducida por los complejos heridas leves a moderadas y no son 100% efectivos para prevenir el riesgo de amputación y recuperar las funciones completas de la piel.9,10. Por lo tanto. Se (Fig.1F). Se trataron células HEK293 de riñón embrionario humano con complejos (10 µM) durante 8 h, y se determinó la actividad luciferasa necesita desesperadamente el desarrollo de nuevos fármacos o terapias para el impulsada por HRE de los lisados celulares. Se esperaría que los tratamiento de la cicatrización de heridas diabéticas en la práctica clínica. complejos que inhiben la interacción entre VHL y HIF-1α aumenten el nivel de actividad luciferasa impulsada por HRE en los lisados La cicatrización de heridas es un proceso sistemático y dinámico que implica celulares. El complejo Rh (III) Rh (brpy)2(dmeophen) 1 (donde brpy = 2epitelización, angiogénesis, formación de tejido de granulación y contracción de (4-bromofenil) piridina y dmeofen = 4,7-dimetoxi-1,10-fenantrolina) la herida, todos los cuales están regulados por el factor 1-α inducible por hipoxia emergió como el principal candidato en la primera ronda de selección (HIF-1α).11,12. En tejidos normales, los niveles de HIF-1α en estado estacionario (Fig. 1b), con una actividad ligeramente superior en comparación con son bajos debido a la hidroxilación dependiente de oxígeno de HIF-1α por las proteínas del dominio de prolil hidroxilasa (PHD)13. Esto permite que HIF-1α se el compuesto de control positivo, P1 ((2S)-4- hidroxi-1- (2 - (((Z) -Ácido 2- (3-metoxibenciliden) -3-oxo-2,3-dihidro benzofuran-6-il) oxi) acetil) combine con la proteína supresora de tumores de Von Hippel-Lindau (VHL) para generar un complejo que el proteasoma reconoce fácilmente y se degrada pirrolidina-2-carboxílico) (Figura complementaria 1), un inhibidor del VHL-HIF que se informó anteriormente -1α PPI descubierto por rápidamente.14,15. En particular, la hiperglucemia puede disminuir la estabilidad nuestro grupo33. de HIF-1α, lo que lleva a la inhibición de la expresión del gen diana de HIF-1α, lo que podría explicar la mala cicatrización y las complicaciones de las úlceras en pacientes diabéticos.dieciséis. Esto sugiere que las estrategias para mejorar la estabilidad de HIF-1α, como el bloqueo de la interacción entre VHL y HIF-1α, podrían ser una estrategia prometedora para el tratamiento de las complicaciones de la herida de la diabetes. Actualmente, varios inhibidores de los PHD notificados como estabilizadores de HIF-1α han entrado en ensayos clínicos para el tratamiento de la anemia crónica.17. Sin embargo, los inhibidores de PHD están asociados con efectos secundarios, como la necrosis hepática fatal para FG-2216, lo que genera preocupaciones sobre su seguridad y tolerabilidad para

Basado en la estructura del complejo 1, Se diseñó y sintetizó una biblioteca enfocada de 14 complejos Rh (III) e Ir (III) ciclometalados que contienen diferentes ligandos donantes C ^ N o N ^ N (1a – 1n) (Higo. 1C). Esta biblioteca se enriqueció en los ligandos brpy C ^ N y dmeophen N ^ N que se identificaron en la primera ronda de selección como subestructuras favorables para la potencia. En la segunda ronda de cribado, el complejo Ir (III)1a, que contiene dos ligandos C ^ N de 2-fenilpiridinas (ppy) y el ligando dmeophen N ^ N, mostró la mayor activación de la actividad luciferasa

un uso generalizado.18.

impulsada por HRE y fue aproximadamente dos veces más potente que el complejo original1 así como el compuesto de control positivo P1 (Higo. 1D). En particular, complejo1a demostró una estabilidad notable en un [D6]

Las interacciones proteína-proteína (IBP) son objetivos atractivos en el descubrimiento de fármacos19. Por ejemplo, venetoclax, un inhibidor del

DMSO / D2Solución de O (9: 1) durante al menos 7 días a 298 K según lo verificado por 1Espectroscopía H RMN (Fig.2 complementaria) y en

linfoma 2 de células B utilizado para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica, fue el primer inhibidor de molécula pequeña de los IBP aprobado

acetonitrilo / H2Solución de O (9: 1) durante al menos 7 días a 298 K según lo determinado por espectroscopia UV / Vis (Fig. 3 complementaria).

por la FDA.20. Ciulli y colaboradores fueron los primeros en informar un inhibidor de la interacción proteína-proteína VHL-HIF-1α genuino VH298

Para investigar más a fondo la potencia del complejo 1a para modular la

como una sonda química de alta calidad de la cascada de señalización de HIF en la vía de señalización de hipoxia21. Este inhibidor representó un

actividad transcripcional de HIF-1α, se llevó a cabo un ensayo de respuesta a la dosis. Los resultados mostraron ese complejo1a exhibió una activación

punto de partida atractivo para el desarrollo de posibles nuevas terapias dirigidas a la señalización de la hipoxia.21-23.

dependiente de la dosis de la actividad luciferasa impulsada por HRE en células HEK293 (Fig. 1mi). Además, los efectos de los ligandos aislados de

Durante la última década, se han explorado compuestos a base de metales que poseen varias ventajas prometedoras para seleccionar los IBP. 24. Los complejos metálicos, con su alta diversidad estructural y

complejos1a sobre la actividad luciferasa impulsada por HRE también se estudiaron. Los resultados mostraron que ni brpy ni dmeophen tenían ningún efecto significativo sobre la actividad luciferasa impulsada por HRE

propiedades estéricas y electrónicas fácilmente ajustables, pueden adoptar una amplia gama de formas geométricas basadas en el estado de oxidación

(Fig. 4 complementaria). Esto demuestra el papel del centro Ir (III) en la coordinación de la estructura de todo el complejo para conferir actividad

de su centro metálico y la naturaleza de sus co-ligandos.25-30. Las sofisticadas geometrías tridimensionales disponibles para los complejos de

transcripcional de HIF-1α.

metales de transición podrían permitirles ser más efectivos en la generación de compuestos con formas adecuadas y grupos funcionales que son complementarios a las regiones de unión de las superficies de PPI.31,32. En este estudio, informamos la identificación de un complejo de iridio (III) como un potente inhibidor del VHL-HIF-1α PPI, que puede inducir eficazmente la acumulación de HIF-1αen celulo e in vivo. Además, también evaluamos el potencial de este complejo en la cicatrización de heridas en tres modelos de ratones diabéticos, incluido el receptor de leptina deficiente (db / db), Modelos de ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ) y dieta alta en grasas / tratados con estreptozotocina (HFD / STZ), lo que demuestra que el bloqueo de la interacción VHL y HIF-1α es una estrategia viable para tratar las úlceras diabéticas. 2

El complejo 1a se une a VHL y antagoniza la interacción de VHL-HIF-1α en celulo. Realizamos experimentos de co-inmunoprecipitación (co-IP) para comprender mejor el mecanismo de acción del complejo 1a. Las células HEK293 se incubaron con complejo1a durante 2 h, y los lisados celulares se sometieron a co-IP usando anticuerpos VHL. Los resultados mostraron ese complejo1a redujo de manera dependiente de la dosis la cantidad de HIF-1α-OH que coprecipitaba con VHL, lo que sugiere que fue capaz de inhibir la interacción VHL-HIF-1α en las células tratadas (Fig. 2ay Fig.5 complementario).

En general, se sabe que la eficacia de la terapéutica depende del grado de unión del fármaco a la diana.

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Fig. 1 Efecto de los complejos sobre la activación de HIF-1α del informador dirigido por HRE según se determina mediante un ensayo de informador de luciferasa dual. aEstructuras químicas de las pequeñas moléculas utilizadas para el cribado preliminar. Todos los complejos son como PF racémicos-

6 sales.

B Efecto de los complejos 1-14 sobre la activación de HIF-1α del HRE-

reportero impulsado. Las células HEK293 se trataron con complejos.1-14 o P1 durante 8 h. Las barras de error representan las desviaciones estándar (SD) de los resultados de tres experimentos independientes.PAG Los valores se calcularon utilizando un método de dos caras. t-prueba. *P < 0,05, **P < 0,01 frente al grupo DMSO. C Estructuras químicas de la biblioteca enfocada de complejos ciclometalados Ir (III) y Rh (III). D Efecto de los complejos 1a – 1n sobre la activación de HIF-1α del informador impulsado por HRE. Las células HEK293 se trataron con complejos.1a – 1n o P1 durante 8 h. mi Efecto dosis-dependiente del complejo 1a sobre la actividad impulsada por HIF-1α. Las células HEK293 se trataron con las concentraciones indicadas de complejo1a durante 8 h. Los datos se expresan como medias ± DE (n = 3 experimentos independientes), PAG Los valores se calcularon utilizando un método de dos caras.t-prueba. #P < 0.05 1a vs.P1, NS (no significativo, P> 0,05) 1 frente a P1. *P < 0,05, **P < 0,01 frente al grupo DMSO. F Diagrama esquemático del DLR que muestra los plásmidos HRE-luciferasa y pRL-TK cotransfectados en células HEK293. Los datos se expresan como medias ± DE (n = 3 experimentos independientes). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

proteína. Por lo tanto, se realizó el ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA) para verificar el compromiso entre el complejo1a y VHL y PHD2. Después de incubar lisados de células HEK293 con complejo1a

Complejo VBC (Fig. 6c complementaria). También verificamos la interacción de alta afinidad de VBC con el péptido HIF-1α DEALAHyp-YIPD34-36, que participa en la mediación de la interfaz VHL-HIF-1α (Fig. complementaria 6d-

seguido de calentamiento hasta las temperaturas establecidas, los niveles de VHL y PHD2 en la fracción soluble se cuantificaron mediante

f). La estabilización del complejo1a hacia VBC también se corroboró usando un ensayo de desplazamiento térmico de proteínas (FTS) basado en

transferencia Western. En presencia de complejos1a (3 μM), se observó un cambio obvio de aproximadamente 6 ° C en la curva de fusión de VHL (Fig. 2

fluorescencia, que reveló un cambio marcado de la curva de fusión (aproximadamente 3,0 ° C) de VBC purificado en presencia de complejo 1a

B). Este resultado indica que complejo1a podría estabilizar VHL en lisados celulares. En contraste, complejo1a no tuvo un efecto apreciable sobre la

con VH298 (aprox. 5,0 ° C) como control positivo (Fig. 2C). Mientras tanto, la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) reveló unaKD valor de 1.08 ± 0.20

estabilización térmica de PHD2 (Fig. 2B). Realizamos más experimentos biofísicos para demostrar la unión directa de complejos1a a VHL in vitro.

μM (Fig. 2d) entre complejo 1a y complejo VBC, similar al KD valor de 2,06 μM determinado mediante un ensayo de polarización de fluorescencia

Primero preparamos plásmidos para expresar y purificar el complejo VHL: ElonginB: ElonginC (VBC) recombinante humano (Fig. 6a complementaria),

competitivo (Fig. 2mi). Los datos de ITC en la Fig.2d también indica que 1a se une al complejo VBC con una estequiometría 1: 1, y que la unión entre 1a

que se verificó usando un ensayo de reducción (Fig. 6b complementaria). Las mediciones de dicroísmo circular (CD) mostraron un cambio distinto de la señal cuando el complejo VBC se incubó con 3 μM de1a en DMSO al 1%,

y VBC está fuertemente impulsado por la entalpía (ΔG = -8,14 kcal / mol, TΔS = -0,29 kcal / mol, ΔH = -7,85 kcal / mol), lo que sugiere que los enlaces de hidrógeno y las interacciones electrostáticas pueden desempeñar un

mientras que no se observaron cambios significativos con DMSO al 1% solo, lo que indica que 1apodría regular la estructura secundaria de VBC

papel clave en esta unión. Además, la cinética de unión de1a de VBC se caracterizó por interferometría de biocapa (BLI),

mediante la unión directa a COMUNICACIONES DE LA NATURALEZA | (2021) 12: 3363 | https://doi.org/10.1038/s41467-021-23448-7 | www.nature.com/naturecommunications

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Fig. 2 El complejo 1a interrumpe la interacción VHL-HIF-1α activando selectivamente VHL. aComplejo 1a inhibe la interacción de VHL-HIF-1α en celulo.Las células HEK293 se trataron con vehículo DMSO (1% durante 2 h), 1a (0,3, 1, 3, 6 y 9 μM durante 2 h), VH298 (100 μM durante 2 h), MG132 (20 μM durante 3 h) o FG-4592 (100 μM durante 2 h) antes de la lisis. Los lisados celulares se recogieron y se incubaron con anticuerpo VHL durante la noche a 4ºC. Las proteínas se inmunoprecipitaron usando perlas de agarosa. Los niveles de hidroxi-HIF-1α coprecipitados con VHL se detectaron usando un anticuerpo hidroxi-HIF-1α.B Ensayos de cambio térmico celular para monitorear el compromiso de la diana celular de VHL y HIF-1α. Los lisados de células HEK293 se trataron con1a (3 μM) a temperatura ambiente durante 30 min y luego se calienta a diferentes temperaturas que van desde 48 a 68 ° C durante 5 min. Las muestras de proteínas se recogieron y detectaron mediante transferencia Western utilizando anticuerpos VHL o PHD2.C Ensayo de desplazamiento térmico de proteínas basado en fluorescencia de VBC en presencia o ausencia de VH298 (100 μM) y complejo 1a (100 µM).D Titulación ITC de complejo 1a (300 μM) en proteína VHL recombinante (30 μM). Los experimentos de ITC se llevaron a cabo en un calorímetro de titulación isotérmica MicroCal PEAQ-ITC (Malvern Panalytical).mi Se realizó un ensayo de unión de polarización de fluorescencia competitiva para evaluar el desplazamiento de un péptido fluorescente (FAM-DEALAHyp-YIPD) que se une a VBC (KD = 421,50 ± 65,23 nM) por complejo 1a. El IC50 de complejo 1a (KD = 2,06 µM) se determinó que era 3,79 µM en presencia de péptido fluorescente 125 nM y VBC 450 nM usando una ecuación logística de cuatro parámetros. F Análisis cinético BLI de la interacción entre complejos 1a y VBC. VBC se inmovilizó en la superficie a biosensores de Ni-NTA. Sensorgramas BLI que muestran la unión de complejos1a a VBC inmovilizado en la superficie. losKD Los valores para una interacción 1: 1 se calcularon a partir del ajuste cinético (KD = 6,74 ± 0,19 μM) y ajuste de estado estable(KD = 5,80 ± 0,64 μM), respectivamente. Las puntas del biosensor de Ni-NTA recubiertas con VBC marcado con His se sumergieron en concentraciones crecientes de1a (0,78, 1,56, 3,13, 6,25 y 12,5 μM) para medir la afinidad de unión de 1a a VBC (ksobre = 5,22 × 102 METRO−1 s−1) y posteriormente se trasladó a pozos que contienen tampón para medir las tasas de disociación (kapagado = 3,52 × 10−2 s−1). Los datos se expresan como medias ± DE (n = 3 experimentos independientes para figuras a y B, muestras para las figuras cy mi), PAG Los valores se calcularon utilizando un método de dos caras. t-prueba. *P < 0,05, **P < 0,01 frente al grupo DMSO. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

que reveló que 1a unido al complejo proteico VBC marcado con His recombinante inmovilizado con KD ...