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Microbiología II Taxonomía

Conceptos de Taxonomía y Sistemática Taxonomía (del griego: taxis –estructuración u orden-; nomos –leydistribuir o gobernar) es la ciencia de la clasificación biológica. Dispone a los organismos en grupos denominados, Taxones en base a sus semejanzas Taxón: grupo de organismos, considerado como una unidad en cualquier rango del sistema clasificatorio. Nomenclatura

Asignación de nombres a grupos taxonómicos en conformidad con las normas publicadas

Identificación

Proceso que permite determinar si una cepa aislada pertenece a un taxón reconocido

Sistemática estudio científico de los organismos cuyo objetivo final es caracterizarlos y agruparlos de forma ordenada, de forma que expresen los diversos grados de similitud entre ellos. Asocia Taxonomía y Filogenia.

Clasificación

Objetivo

Ordenar los millones de especies diferentes que pueblan este planeta

Tipos de Clasificación

Fenética

Filogenética

Genotípica

Clasificación Fenética agrupa a los organismos en base a las semejanzas de sus características fenotípicas  Pueden revelar posibles relaciones evolutivas  No dependen del análisis filogenético  Se comparan muchos rasgos sin tener en cuenta que ciertas características son más importantes desde el punto de vista filogenético que otras

 La mejor clasificación fenética es la que se desarrolla comparando el mayor nº posible de atributos.  Los organismos que comparten muchas características constituyen un grupo único o taxón.

Clasificación Filogenética o Filética agrupa a los organismos en base a sus relaciones evolutivas.

 Registro fósil  Secuencias de nucleótidos de rRNA Clasificación Genotípica: compara las semejanzas genéticas entre los organismos. Pueden compararse genes individuales o genomas completos.  Los procariotas cuyos genomas presenten una homología de más de un 70% pertenecen a la misma especie Taxonomía Polifásica: Este enfoque fenotípicas, filogenéticas y genotípicas.

incluye

características

Sistemas de Clasificación Aristóteles (350 a.C.) dividió a los organismos en dos categorías: Animales y Plantas.

En 1735, el botánico sueco, Carl Von Linné (Carolus-Linnaeus) clasificó todos los organismos conocidos en dos grandes grupos: los reinos Plantae y Animalia. Subdividió cada categoría en otras progresivamente más pequeñas. Desarrolló un sistema para dar nombre a todos los organismos: sistema binomial.

Darwin (1859) elaboró la teoría de la evolución, a partir de entonces se comenzaron a emplear clasificaciones que reflejaban las relaciones reales de parentesco entre organismos procedentes de antecesores comunes.

Erns Haeckel (1866) introdujo el tercer reino: Protista, en el que incluía a todas las formas de vida simples (algas, hongos, protozoos, bacterias).

Lynn Margulis & H.F. Copeland, en 1956 propusieron un sistema de clasificación de 4 reinos: Plantae, Animalia, Protoctista (protozoos, algas, hongos) y Monera (bacterias)

Robert Whittaker en 1969 propuso cinco reinos: Plantae, Animalia, Fungi, Protista (protozoos, algas), y Prokaryotae o Monera (bacterias). (Black, 2013; Fig. 9.5)

Woese, en 1990 propuso una nueva categoría taxonómica: Dominio.

(Black, 2013; Fig. 9.11)

En la actualidad se reconocen tres dominios: Archaea , Bacteria y Eukarya

(Black, 2013; Fig. 9.13)

Categorías Taxonómicas

Disposición en niveles taxonómicos jerárquicos sin superposiciones, de forma que los microorganismos situados en cada nivel (categoría taxonómica o rango taxonómico) comparten una serie común de rasgos específicos.

A medida que se desciende del nivel dominio al de especie a través de la jerarquía taxonómica, los criterios utilizados para distinguir organismos se hacen menos generales y más específicos.

Domi Dominio nio Phylu Phylum m Cl Clase ase Ord Orden en Fami Familia lia Géne ro Género Esp ec ie Espec ecie

ESTRUCTURACIÓN JERÁRQUICA EN TAXONOMÍA

(Willey, 2011, Fig.17.1)

Definición de Especie Eucariotas Una especie está formada por grupos de poblaciones que pueden entrecruzarse en condiciones naturales, produciendo descendencia fértil y que están aislados desde el punto de vista reproductivo de otros especies.

Procariotas Una especie es una colección de cepas que comparten numerosas propiedades estables y difieren significativamente de otros grupos de cepas.

Una cepa está formada por los descendientes de un único cultivo microbiano puro.

Cepa tipo: la primera descubierta y mejor caracterizada.  ATCC: American Type Culture Collection, Marylan , EEUU.  CETC: Colección Española de Cultivos Tipo. Dpto. Microbiología, Facultad de Biología. Universidad de Valencia.  DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos)

Categorías a nivel de subespecie: Biovariedades: variantes de cepas procariotas caracterizadas por diferencias bioquímicas y fisiológicas. Morfovariedades: morfológico

se

diferencian

desde

el

punto

de

vista

Serovariedades o serotipo: cepas que presentan propiedades antigénicas diferenciadoras. Fagovariedad: cepas que presentan diferente sensibilidad a fagos Patovariedad: cepas que presentan propiedades patógenas diferenciadoras.

Actualmente el criterio empleado para la definición de especie es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas, genómicas y filogenéticas).  Fenotípicos:  Clásicos (morfología, nutrición, tinción, fisiología….)  Moleculares (análisis de metil ésteres de ácidos grasos, peptidoglicano, LPS, citocromos….)  Genéticos  % G+C; hibridación DNA-DNA; análisis de secuencias multilocus; huella genómica….  Filogenéticos  Basados en el gen rRNA 16 S

ESPECIE: Grupo natural de organismos relacionados que se distinguen de grupos similares por una serie de características ecológicas, fenotípicas y genéticas Definición metodológica estándar:  % de Hibridación DNA > 70%  < 5% de diferencia en su Tm  < 3% diferencia secuencia rRNA 16S (> 97 % similaridad)

Género es un grupo de especies estrechamente relacionados > 5 % diferencia secuencia rRNA 16S (95% similaridad)

Familia es un grupo de géneros estrechamente relacionados Orden es un grupo de familias estrechamente relacionadas Clase es un grupo de órdenes estrechamente relacionadas Phylum es un grupo de clases estrechamente relacionadas

(Madigan, 2012; Fig. 16.23)

(Madigan, 2006; Tabla 11.6)

Se han descrito aproximadamente 10.000 especies Se sospecha que existen entre 105 a 106 especies de procariotas

Nomenclatura Sistema binomial de nomenclatura propuesto por el botánico sueco Carl Von Linné (CarolusLinnaeus)

El nombres latinizados y en cursiva o subrayados.

 El primer nombre, escrito con mayúscula, es el nombre genérico.  El segundo nombre, en minúscula, es el epíteto de la especie. Escherichia coli

A menudo se abrevia el nombre genérico con una letra mayúscula. E. coli

Manual Bergey

Comité Internacional sobre Sistemática de Procariotas http://www.bacterio.cict.fr

http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm 1ª edición 1984: Agrupación Fenética 2ªedición Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Agrupación filogenética. Incluye información ecológica Volumen 1 (2001): Archaea , Bacterias fototróficas y Bacterias evolutivamente más antiguas Volumen 2 (2005): Proteobacteria (tres partes) Volumen 3 (2006): Bacterias Gram-positivas con bajo contenido en G + C Volumen 4 (2007): Bacterias Gram-positivas con alto contenido en G + C Volumen 5 (2007): Planctomycetes, Espiroquetas, Fibrobacteres, Bacteroidetes, Fusobacterias.

Organización del Bergey´s

(Madigan, 2012; Apéndice 2)

Organización del Bergey´s

(Madigan, 2012; Apéndice 2)

The Prokaryotes: 11 volúmenes

Nueva especie 1. Debe publicarse en “International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology” (IJSEM): Publicación oficial de los registros de Taxonomía y clasificación de procariotas. 2. Depositar la nueva especie en alguna colección de cultivos en al menos 2 países

(Madigan, 2012; Tabla 16.5)

CECT

Colección española de cultivos tipo

Valencia

http://www.cect.org

Métodos Taxonómicos

Similitud en moléculas u organización superior (fenotípica) Similitud en genes (genotípica)

Métodos Fenéticos Determinación de características fenotípicas Características morfológicas.  Morfología de las colonias  Tinción Gram u otras diferenciales  Forma y tamaño celular  Flagelos, cilios, mecanismo de motilidad

 Forma y localización de la endospora  Esporas: forma y localización  Inclusiones celulares

Características fisiológicas y metabólicas  Fuentes de C, N y E  Tipo de metabolismo  Relación con el oxígeno

 Tª óptima de crecimiento y rango  pH óptimo y rango de crecimiento,  Tolerancia osmótica; necesidades y tolerancia a NaCl  Luminiscencia

Características ecológicas Relaciones simbióticas

Pruebas bioquímicas convencionales Claves dicotómicas Cepa (EMB Levine) Gram +

Gram -

Lactosa + Indol +

Lactosa -

Indol -

E. coli Citrato +

Citrato -

Citrobacter freundii VP +

VP -

Enterobacter Klebsiella pneumoniae aerogenes

Sistemas Rápidos Multiprueba API

Sistemas Automatizados

Panel comercial para identificación y determinación de sensibilidad a antimicrobianos en bacterias.

Aparato para lectura e interpretación de paneles comerciales para identificación y estudio de sensibilidad de bacterias

Serotipado Diferencia los microorganismos de una misma especie detectando sus Ag de superficie mediante una colección de Ac específicos.

Ag somático O Ag capsular K Ag flagelar H

Diagnóstico de bacterias patógenas

Fagotipado Diferencia los microorganismos de una misma especie basándose en el perfil de sensibilidad de una cepa bacteriana a una colección de bacteriófagos de infectividad restringida.

(Willey, 2011; Fig. 5.13)

(Tortora, 2014; T. 10 Fig.13)

Análisis de ácidos grasos (FAME: Fatty Acid Methyl Ester) Caracterización de los tipos y proporciones de ácidos grasos presentes en los lípidos de la membrana citoplasmática y de la membrana externa de la pared celular.

(Madigan, 2012; Fig. 16.19)

Clasificación Fenética Taxonomía dicotómicas.

Clásica:

pondera

caracteres,

utiliza

claves

Taxonomía Numérica: cada carácter tiene igual peso, la similitud es función de la proporción de caracteres comunes. Estimación cuantitativa ”Agrupamiento mediante métodos numéricos de unidades taxonómicas en taxones, en base al estado de sus caracteres” Se obtiene información acerca de las propiedades del organismo, determinando la presencia o ausencia de caracteres seleccionados.  Un carácter se define como un atributo acerca del cual es posible realizar una única afirmación  Nº mínimo de caracteres seleccionados: 50

 Variedad de caracteres: bioquímicos, genéticos.

morfológicos,

fisiológicos,

Se calcula para cada par de organismos del grupo un coeficiente de asociación, que es una función que determina la concordancia de caracteres que presentan esos dos organismos Valor de los coeficientes:  0  1 Coeficiente de emparejamiento simple (Sm): consideran todos los caracteres que concuerdan, independientemente de que estén presentes o ausentes. Coeficiente de Jaccard (Sj): no tiene en cuenta los caracteres ausentes en ambos organismos.

(Willey, 2009; Tabla 19.2)

Formación de una matriz de similitud, en la que las filas y columnas representan microorganismos. Cada valor es un coeficiente de asociación que mide la semejanza entre organismos diferentes.

(Willey, 2009; Fig. 19.6)

Fenones: organismos semejantes que se agrupan juntos y separados de otros grupos.

Dendrograma

Cepas 1 y 2

Fenon 90

Cepas 1 y 3

Fenon 80

Los fenones formados en una semejanza aproximadamente del 80% a menudo equivalen a la especie (Willey, 2009; Fig. 19.6)

Métodos Genéticos Determinación de características moleculares Composición de ácidos nucleicos

% G+C =

Procedimiento  Calentamiento suave y determinación de Abs a 260 nm  Determinación de la Tª de fusión (Tm)

G+C

x 100 (A+T)+ (G+C)

Promedio de contenido en G+C

Animales y Plantas Microorganismos

(Madigan, 2006; Fig. 11.21)

30-50%

25-80%

Si dos organismos difieren en más de un 10% en el % de G+C, sus genomas presentan secuencias de bases muy diferentes. Generalmente la variación dentro de un género es inferior al 10%.

Dos organismos con un contenido de G+C muy parecido no tienen por que tener secuencias de bases muy similares. Se pueden construir secuencias muy distintas con % de pb iguales.

Se precisa comprobar similaridad fenotípica

(Willey, 2011; Tablas 17.3)

Hibridación DNA- DNA

Desnaturalización DNA

Incubación: Tª 30-50ºC < Tm

(Tortora, 2014; T 10 Fig. 15)

Las cadenas con secuencias similares pero no idénticas se asocian para formar híbridos de DNA bicatenario menos termoestables.

Determina el grado de similitud de secuencias. Permite diferenciar organismos relacionados  Hibridación > 70% y < 5% diferencia Tm: misma especie.

 Hibridación > 25%: mismo género  Hibridación < 10%: organismos no relacionados

(Willey, 2011; Tablas 17.4)

Análisis de la secuencia del gen 16S rRNA Alineación de la secuencia Comparación con Bases de Datos (http://rdp.cme.msu.edu/htlm/) Lista cepas con mayor porcentaje de similitud Diferencia con la secuencia de la cepa más similar

3%

Comparación de fenotipos Diferente

Nueva especie

Similar

Hibridación DNA-DNA

Misma especie < 70%

> 70%

Secuencias Signatura Se trata de secuencias de nucleótidos cortas y conservadas que son específicas para un grupo filogenéticamente definido de organismos.

 Existen secuencias signaturas típicas para cada uno de los

tres dominios: Bacteria, Archaea y Eucarya.

(Madigan, 2006; Tabla 11.1)

 Se conocen secuencias signaturas que definen un grupo específico dentro de un dominio e incluso algunas que pueden distinguir algún genero o especie.

(Willey, 2009; Tabla 19.8)

Taxonomía microbiana

 Aplicación Diseño de sondas de nucleótidos específicos (sondas filogenéticas)

Sondas FISH Sondas

Cadenas de ácido nucleico que pueden ser marcadas y utilizadas para hibridar con un ácido nucleico complementario presente en una mezcla.

Sondas Fish (Hibridación fluorescente in situ)  La sonda lleva unido un colorante fluorescente.  Se realiza un tratamiento de las células con reactivos adecuados para incrementar la permeabilidad de las membranas y permitir la penetración de la sonda-colorante.  La sonda hibrida con el rRNA en los ribosomas  Las células se vuelven uniformemente fluorescentes y pueden observarse con un microscopio de fluorescencia.

 Ventajas: Puede aplicarse a células en cultivo o en su medio ambiente natural.  Utilidad: ecología microbiana y diagnóstico clínico

FISH : Fluorescent In Situ Hibridation (Hibridación Fluorescente In Situ) 

Marcamos la sonda (Oligonucleótido Firma) con un fluorocromo.



La añadimos sobre la muestra , incubamos y lavamos…

Si la sonda hibrida con su diana, el microorganismo se colorea con el color del fluorocromo y será visible al Microscopio de fluorescencia.

Tipos de sondas  Generales: se unen a secuencias conservadas en el RNAr de un organismo  Específicas: reconocen géneros o especies gracias a secuencias firma que se encuentran en su RNA . Se pueden diseñar para que reconozcan un género o una especie determinada.

S. aureus

Contraste de fase

(Tortora, 2014; T. 10, Fig.18)

Sondas Fish

Muestra de lodo marino

Nitrificantes: oxidantes de amonio en rojo y en verde oxidantes de nitrito

Muestra tratada con varias sondas con fluorocromos diferentes

(Madigan, 2012; Fig. 22.10)

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009254104000075

Nemátodo marino (Leptonemella) recubierto de bacterias epibiontes

Simbiontes en branquias de mejillón gigante del Golfo de Méjico. Técnica FISH con Oligonucleótidos Firma para metanotrofos (verdes) y bacterias sulforreductoras (rojas).

Endosimbiontes bacterianos en tejido de un oligoqueto marino (O. crassitunicatus). Triple hibridación : gamma-proteobacterias (rojo), delta-proteobacterias (azul) y espiroquetas (amarillo)

Instituto Max Planck de Microbiología Marina. Bremen (Alemania) http://www.mpi-bremen.de/Forschungsgebiet_54.html

ISH : In Situ Hibridation (Hibridación In Situ) Puede aplicarse sobre cortes histológicos, para localizar bacterias simbiontes endocelulares 1) Marcamos la sonda (el oligonucleótido firma con biotina o con digoxigenina ( )

)

2) Añadimos la sonda marcada al corte del tejido para que hibride con su diana (si está) y lavamos la sonda no hibridada. 3) Tratamos el corte histológico con un anticuerpo contra biotina o digoxigenina ( ) y lavamos. (El anticuerpo va unido a un enzima ( ). Ejemplo : fosfatasa alcalina) 4) Añadimos el sustrato del enzima (

)

La reacción del enzima provoca, que se tiña la zona donde está la sonda hibridada a su diana

Corte histológico de epitelio digestivo de Haliotis (Oreja de mar) tratado mediante ISH. Las zonas negras (flechas) son Rickettsias (parásitos endocelulares). Observación al microscopio electrónico.

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Se amplifican genes específicos mediante PCR y posteriormente son tratados con endonucleasas de restricción. EcoRI

AATTC CTTA G

SmaI

CC GGG GG CC

Fragmentos de restricción

Se basa en que diferencias en las secuencias se traducen en presencia o ausencia de sitios de corte para los enzimas de restricción Los microorganismos que presenten el mismo patrón de fragmentos de restricción están probablemente muy relacionados. Permite diferenciar especies e incluso cepas de una misma especie

El patrón de fragmentos de restricción se observa mediante electroforesis en gel de agarosa. Se obtiene un perfil del DNA o huella genómica.

(Tortora, 2014; T. 10 Fig.14)

Permite la identificación a nivel de especie, subespecie y cepa Estudio de la diversidad microbiana Utilidad

Identificación de patógenos

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Digestión del DNA con uno o 2 enzimas de restricción Amplificación por PCR de los fragmentos resultantes Separación de los fragmentos por electroforesis en geles de agarosa obteniéndose un perfil de bandas Permite la dif...