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Ensayo sobre tecnología de hibridoma...

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TECNOLOGÍA DE HIBRIDOMA

Se refiere al fenómeno de que dos o más celdas se fusionan en una celda. Puede hacer que el núcleo de dos fuentes diferentes exprese la función en la misma célula. Visión general La técnica de fusionar células de mieloma y linfocitos inmunes (linfocitos B inmunes) para formar células de hibridoma que pueden secretar un anticuerpo monoclonal altamente puro. definición Técnica de hibridoma Esa tecnología

de hibridoma

de

linfocitos ,

también

conocida

como tecnología de anticuerpos monoclonales . Fue desarrollado sobre la base de la tecnología de fusión de células somáticas. Kohler y Milstein (1975) demostraron

que las células

del bazo de

los animales

de mieloma se inmunizados

fusionan con para formar

las células un anticuerpo

monoclonal, homogéneo y altamente específico , que secreta el antígeno. La tecnología se conoce comúnmente como tecnología de hibridoma. La base de esta tecnología es la tecnología de fusión celular. Las células de mieloma

pueden pasarse en serie in vitro, mientras que las células del bazo son células terminales y no pueden propagarse in vitro. Si las células de mieloma de ratón se fusionan con linfocitos que secretan un anticuerpo o factor , las células fusionadas tienen las características de proliferación infinita de células tumorales y la capacidad de los linfocitos para secretar anticuerpos o factores específicos, pero también superan Las deficiencias de los linfocitos inmunes no

pueden

reproducirse

in

vitro,

las

células

fusionadas

se

denominan hibridomas de linfocitos . Antecedentes Kohler y Milstin inventaron la tecnología de hibridoma de linfocitos en 1975, y finalmente resolvieron el problema de la preparación de anticuerpos puros. La tecnología de hibridoma se desarrolla a partir de la tecnología de fusión celular. Los anticuerpos son globulina secretada por los linfocitos B inmunizados, y los anticuerpos secretados por cada linfocito son diferentes. Por lo tanto, la única forma de obtener un anticuerpo puro es a partir de una población celular producida por un linfocito B. Sin embargo, los linfocitos B no pueden sobrevivir durante mucho tiempo in vitro y mueren después de dos o tres divisiones, y por lo tanto no pueden obtener una gran cantidad de anticuerpos secretados por un grupo de células de progenie (clones) de un linfocito. Las células de mieloma tienen características de

proliferación ilimitadas en condiciones de cultivo in vitro. Los linfocitos B inmunes y las células de mieloma se fusionan para formar células de hibridoma. Esta célula híbrida tiene las características genéticas de las células anfifílicas. No solo puede secretar anticuerpos como los linfocitos B, sino que también

prolifera

indefinidamente

como

las

células

de

mieloma,

convirtiéndose así en "células inmortales" que secretan anticuerpos. Basado en este principio, Kohler y Milstin inventaron con éxito la tecnología de hibridoma. Principios y pasos El principio básico de la tecnología de hibridoma es fusionar dos células mientras se mantienen las características principales de las dos. Estos dos tipos de células son células de bazo de ratón y células de mieloma de ratón inmunizadas con antígeno . La característica principal de las células de bazo de ratón ( linfocitos B ) inmunizadas con antígenos específicos es su función de secreción de anticuerpos, pero no puede cultivarse continuamente in vitro . Las

células

de

mieloma

de

ratón

pueden dividirse

y

proliferar

indefinidamente en condiciones de cultivo . La llamada inmortalidad. Bajo la acción del medio de selección , solo las células híbridas fusionadas con células B y células de mieloma pueden tener la capacidad de continuar cultivándose,

formando un clon celular que tiene las características de secreción de anticuerpos y el mantenimiento de la inmortalidad celular . El principio se aclara a partir de los siguientes tres pasos principales. (1) Selección celular y fusión El propósito de establecer la tecnología de hibridoma es preparar anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno, por lo que la célula de fusión debe seleccionar las células B inmunizadas con el antígeno, generalmente derivadas de las células del bazo del animal inmunizado . El bazo es un lugar importante para que las células B se reúnan. No importa qué tipo de método inmune se use, habrá una respuesta de anticuerpos obvia en el bazo. El otro lado de la célula de fusión es mantener la proliferación continua de células después de la fusión celular, y solo las células tumorales tienen esta característica. · Elegir celdas del mismo sistema puede aumentar la tasa de éxito de la fusión. El mieloma múltiple es un tumor maligno de la línea celular B , por lo que es un compañero ideal para la fusión de células del cónyuge. El uso de agentes de fusión celular causa un cierto grado de daño a la membrana celular, haciendo que las células sean propensas a la adhesión y fusión. El mejor efecto de fusión debería ser el menor grado de daño celular

mientras se produce la mayor frecuencia de fusión. El polietilenglicol (PEG 1 000 ~ 2 000) es el agente de fusión celular más utilizado, la concentración de aplicación general es del 40% (p / v). (2) Aplicación del medio de selección La fusión celular es un proceso físico aleatorio. En una suspensión celular mixta de células de bazo de ratón y células de mieloma de ratón , las células aparecerán en diversas formas después de la fusión. Tales como células de bazo fusionadas y células tumorales, células de bazo fusionadas y células de bazo, células tumorales fusionadas y células tumorales, células de bazo no fusionadas,

células

tumorales

no

fusionadas

y formas

de células multiméricas . Las células normales del bazo solo sobreviven durante 5-7 días en el medio sin un examen especial; la forma multimérica de las células también es fácil de morir; y las células tumorales no fusionadas necesitan un examen especial para eliminarlas. Generalmente hay dos vías para la síntesis de ADN celular. La forma principal es sintetizar nucleótidos a partir de azúcares y aminoácidos , y luego sintetizar ADN.El ácido fólico participa en este proceso de síntesis como una coenzima importante. Otra vía auxiliar es la síntesis de ADN a través de la acción

catalítica

de la

enzima

convertidora de hipoxantina

fosforibosilo ( HGPRT )

y

la

timidina quinasa (TK)

en presencia

de hipoxantina y timidina . Hay tres componentes clave en el medio de selección para la fusión celular : hipoxantina (H), metotrexato (aminopterina, A) y timidina (T), por lo que se toma el nombre de los tres. como medio HAT . El metotrexato es un antagonista del ácido fólico, que puede impedir que las células tumorales sinteticen el ADN de la manera normal. Las células tumorales utilizadas para la fusión son cepas de células HGPRT seleccionadas a través de un medio tóxico , por lo que no pueden crecer en este medio. Solo las células fusionadas tienen las propiedades genéticas de ambos padres y pueden sobrevivir y reproducirse durante mucho tiempo en medio HAT. (3) Dilución limitada y selección específica de antígeno En la inmunización animal, se deben usar antígenos de alta pureza. Un antígeno a menudo tiene múltiples determinantes: la respuesta inmune humoral producida por un animal después de ser estimulado por el antígeno es esencialmente la secreción de anticuerpos de muchas poblaciones de células B , mientras que las células B contra el epítopo objetivo representan solo una pequeña parte. Debido a que la fusión celular es un proceso aleatorio, existe una proporción considerable de fusiones celulares no relacionadas en las células que se han fusionado, que deben eliminarse mediante detección. El proceso de selección generalmente se divide en dos pasos: uno es el análisis

de anticuerpos de las células fusionadas y el otro es el análisis de anticuerpos específico basado en esto . Diluya las células fusionadas lo suficiente para que el número de células distribuidas en cada pocillo de la placa de cultivo esté entre 0 y varias células (el 30% de los pocillos son 0 para garantizar que cada pocillo sea una sola célula). El sobrenadante se usa para seleccionar células con alta secreción de anticuerpos mediante ELISA ; este proceso a menudo se denomina clonación . Estas células positivas se clonaron nuevamente y se usó ELISA recubierto con anticuerpos específicos para encontrar líneas celulares positivas para anticuerpos contra el antígeno diana. Después de la proliferación, las células se congelaron, se cultivaron in vitro o se inocularon con animales. solicitud Los anticuerpos monoclonales no solo tienen un valor importante en la investigación básica de biología e inmunología, sino que también tienen una amplia gama de aplicaciones en la práctica. En medicina, los anticuerpos monoclonales se han utilizado en el diagnóstico de enfermedades, y sus ventajas son un diagnóstico preciso y ninguna reacción cruzada. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales utilizados para diagnosticar la hepatitis B y el virus de la hepatitis B latente rara vez pierden diagnósticos falsos. El anticuerpo monoclonal también se puede usar como vehículo farmacológico

para tratar enfermedades. Los anticuerpos monoclonales tienen afinidad específica por los tejidos objetivo, por lo que tienen características específicas de localización y distribución in vivo. La combinación de medicamentos antitumorales y anticuerpos monoclonales contra cierto tumor puede hacer que el medicamento ataque selectivamente las células tumorales en el cuerpo, solo elimine las células objetivo y no dañe los tejidos normales, lo que reduce en gran medida los medicamentos contra el cáncer. efecto secundario. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales portadores de fármacos se denominan "misiles

biológicos". Los

anticuerpos

monoclonales

producidos

son

principalmente del tipo ratón-ratón, que es una proteína heterogénea para los humanos, por lo que es difícil de usar para el tratamiento. Para resolver el rechazo del cuerpo humano de las proteínas de anticuerpos monoclonales heterólogos, los académicos están trabajando arduamente para desarrollar anticuerpos monoclonales humano-humanos para facilitar la aplicación a gran escala del tratamiento de enfermedades....