Tema 1. Métodos de estudio de células y tejidos PDF

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Tema 1. MÉTODOS DE ESTUDIO DE CÉLULAS Y TEJIDOS UNIDAD DIDÁCTICA I CITOLOGÍA BIOLOGÍA CELULAR Y MICROBIOLOGÍA Dra. Eva Mª García Vizcaíno FACULTAD DE ENFERMERÍA

Dra. Eva Mª García Vizcaíno- [email protected] Tlf: (+34) 968 27 88 08 Universidad Católica de Murcia - Tlf: (+34) 968 27 88 00 - www.ucam.edu

BIOLOGÍA CELULAR Y MICROBIOLOGÍA Bibliografía Básica:

- Albert B, et al. Biología molecular de la célula. 4ª ed. Barcelona: Omega; 2010. - Calvo A. Biología Celular Biomédica. Barcelona: Elsevier; 2015 - De la Rosa M, Prieto J. Microbiología en Ciencias de la salud. 3ª ed. Madrid: Elsevier; 2011. - Gartner LP, Hiatt JL. Texto Atlas de Histología. 4ª ed. Madrid: McGraw-Hill; 2015. - Stevens A, Lowe J. Histología humana. Madrid: Elsevier; 2015. Tema 1. Métodos estudio material biológico. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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BIOLOGÍA CELULAR Y MICROBIOLOGÍA Bibliografía Complementaria: - Albert B. Introducción a la biología celular. 2ª ed. Madrid: Panamericana; 2011. - Doménech A. Microbiología básica para estudiantes de enfermería. Palma de Mallorca: Universitat de les Illes Balears; 2007. - Junqueira LC, Carneiro J. Histología Básica. 6ª ed. Madrid: Elsevier; 2005. - Kindt TJ, Goldsby RA, Osborne BA. Inmunología de Kuby. 6ª ed. Madrid: McGraw-Hill; 2007. - Kühnel W. Atlas color de citología e histología. 11ª ed. Madrid: Panamericana; 2005. - Paniagua R. Biología Celular. 3ª ed. Madrid: McGraw-Hill; 2010. - Ross MH. Histología. Madrid: Panamericana; 2012.

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TEMA 1 METODOS DE ESTUDIO DE CÉLULAS Y TEJIDOS

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Milímetro

1 mm = 10-3 m

Micrómetro

1 m = 10-6 m (antes llamado micra)

Nanómetro

1 nm = 10-9 m

Angstron

1 Å = 10-10 m

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1.1. Preparación del material biológico. Fijación - Para evitar la digestión enzimática de tejidos y autólisis celular. - Mediante soluciones químicas: Agentes estabilizadores de moléculas mediante puentes. - Por inmersión en el fijador o mediante perfusión intravascular. - Formaldehído y glutaraldehído son dos de los fijadores más utilizados. Reaccionan con los grupos amino (NH2) de las proteínas. - El glutaraldehído induce la formación de puentes cruzados entre proteínas Tema 1. Métodos estudio material biológico. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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1.1. Preparación del material biológico. Inclusión Infiltración de un medio para dar consistencia al tejido y obtener cortes finos. Espesor: 1 – 100 m.

- Previo a la inclusión: - Deshidratación: inmersión en concertaciones crecientes de etanol del 70% al 100%. - Aclaramiento: el etanol se sustituye por un disolvente orgánico (xilol) que convierte los fragmentos en translúcidos.

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1.1. Preparación del material biológico. Inclusión - Para poder realizar cortes muy finos es necesario dar consistencia rígida: - Parafina: microscopía óptica - Resinas plásticas: microscopía óptica y electrónica. - El fragmento se sumerge en parafina 58-60 ºC, el disolvente se evapora y la parafina ocupa su lugar. La parafina a temperatura ambiente solidifica formando bloques. - Las resinas plásticas se endurecen mediante polimerización (bloques), lo que evita algunos efectos de las altas Tª. Tema 1. Métodos estudio material biológico. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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1.1. Preparación del material biológico. Inclusión

- En el microtomo se obtienen cortes de entre 3-5 µm

- Fijación por congelación rápida. Secciones 8-15µm. Criotomo Tema 1. Métodos estudio material biológico. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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1.1. Preparación del material biológico. Tinción - Tipos de colorantes: - Diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula. - Distinguen componentes fibrosos de la matriz celular. - Sales metálicas que precipitan en los tejidos. - Principales colorantes básicos: - Azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina. - Reaccionan con componentes tisulares que contienen ácidos (basófilos): Ácidos nucleicos, glucosaminoglucanos, proteínas ácidas.

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1.1. Preparación del material biológico. Tinción - Principales colorantes ácidos: - Eosina y fucsina. - Reaccionan con componentes tisulares cuyo pH es básico (acidófilos): gránulos de secreción, proteínas citoplasmáticas, colágeno. Con frecuencia se utilizan tinciones conjuntas (hematoxilina-eosina)

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1.1. Preparación del material biológico. Tinción Otra forma de teñir es utilizando tricrómicos (Tinción de Masson-Goldner, Tricrómico de Gallego)

Piel

Glándula parótida

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1.2. Microscopía óptica. 1.2.1.Microscopio óptico de campo claro Un haz de luz atraviesa el tejido y es recogido por un sistema de lentes que amplían la imagen. El contraste se aumenta por tinción, por lo que la célula muere. Lo importante en un microscopio óptico es el Poder de Resolución (PR):

capacidad de presentar distintos y separados dos puntos adyacentes colocados a una distancia mínima.

Límite de Resolución (LR): distancia

mínima entre dos puntos para que estos puedan distinguirse como tales. Tema 1. Métodos estudio material biológico. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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1. . Microscopía óptic . 1.2.1. Microscopio óptico de campo claro PR = 1/LR LR = k x λ / AN

LR = 0,61x 550 / 1,51 x 0,93 LR = 240 nm

k: Constante estimada en 0,61 λ : Longitud de onda (550 nm)

AN : Apertura numérica = n x sen α n: índice de refracción (aire = 1 ; aceite de inmersión = 1,51)

Límite de resolución del ojo humano 0,23 nm. Se multiplica unas 1000 veces su capacidad de resolución.

α: semiángulo de abertura de la lente, siempre menor que 1, microscopios actuales máximo 0,93 Tema 1. Métodos estudio material biológico. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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1.2. Microscopía óptica. 1.2.2. Microscopio de contraste de fases Este microscopio permite observar las células sin teñir, por lo que se pueden observar células vivas. Los rayos al atravesar la materia viva refractan cambiando de fase. La diferencia fase es de ¼ con respecto a los refractados. Este retraso de fase no detecta el microscopio ordinario.

se de no la

El de contraste de fase posee unos anillos en el condensador y el objetivo que transforman las diferencias de fase en diferencias de amplitud, lo que se expresa en diferencia de intensidad. Mayor contraste. Tema 1. Métodos estudio material biológico. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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1.2. Microscopía óptica. 1.2.2. Microscopio de contraste de fase Una modificación es el microscopio de Nomarski, tiene un prisma birrefringente que hace que el rayo que incide sobre él se divida en dos que interfieren entre sí, proporcionando una imagen aparentemente tridimensional.

M. Contraste de fase

M. óptico

M. Nomarski Células de la cresta neural

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1.2. Microscopía óptica. 1.2.3. Microscopio de luz ultravioleta y de fluorescencia

- Poder de resolución: está relacionado con la longitud de onda de la fuente de luz. - Se mejora el PR con el uso de la luz ultravioleta: 200 nm < λ < 300 nm. - El vidrio es opaco a estas λ, se usan lentes de cuarzo. - Problemas: no se permite observación directa ni de muestras in vivo.

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1.2. Microscopía óptica. 1.2.3. Microscopio de luz ultravioleta y de fluorescencia Microscopio de fluorescencia. Hay compuestos químicos que absorben luz ultravioleta y devuelven parte de la energía como longitud de onda más larga (fluorescencia). Estos compuestos se llaman sondas fluorescentes o fluoróforos.  excitación ≠  emisión.  Usos: detección de proteínas u otras moléculas mediante anticuerpos marcados con sondas fluorescentes. Tema 1. Métodos estudio material biológico. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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1.2. Microscopía óptica. 1.2.3. Microscopio de luz ultravioleta y de fluorescencia Microscopio de fluorescencia. - Fuente de luz: longitud de onda corta. - Dos filtros: entre el foco y la muestra, selecciona la longitud que absorbe la sustancia. El segundo filtra la luz obtenida a partir de la muestra

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1.2. Microscopía óptica. 1.2.5.Microscopio de barrido confocal. Hacer pasar la luz (fuente láser) a través de un objetivo que forma un haz bicónico y puede dirigir los rayos a distintas profundidades de la muestra En el detector de luz se coloca un diafragma que solo permite la entrada de la luz de la zona iluminada, la luz que proviene de otras zonas queda fuera del orificio del diafragma. El haz luminoso se desplaza sobre la muestra realizando un barrido.

Retina de mono

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1.3. Microscopía electrónica. 1.3.1. Microscopio electrónico de transmisión. La longitud de onda de un haz de electrones es menor que la de la luz visible: al aumentar la velocidad del electrón disminuye la longitud. Los electrones son proyectados desde un filamento (cátodo) y acelerados por la diferencia de potencial con el ánodo. Para evitar que los electrones al chocar con las moléculas del aire se desvíen de su trayectoria, se produce el vacío en el interior de la columna La imagen se forma al chocar los electrones con con átomos de elevado nº atómico. La muestra se contrasta 22 con: osmio, cromo, uranio, etc. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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1.3. Microscopía electrónica. 1.3.1. Microscopio electrónico de transmisión. Ernst Ruska 1931

Bobinas electromagnéticas que actúan como lentes: - Una hace de condensador, enfoca el haz hacia la muestra. - La siguiente actúa de objetivo, ampliando la imagen. - Las siguientes como ocular, ampliando aun más la imagen y proyectándola. El poder de resolución mejora: - Con respecto al M. óptico 240 veces. - Con respecto al ojo 240.000 veces. Tema 1. Métodos estudio material biológico. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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1.3. Microscopía electrónica. 1.3.1. Microscopio electrónico de transmisión.

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1.3. Microscopía electrónica. 1.3.2. Microscopio electrónico de barrido.

- Observación de superficies en relieve. - El haz de electrones es móvil y rastrea la muestra punto por punto. - Tienen una profundidad de foco de varios milímetros – imagen tridimensional. - Es necesario recubrir la muestra con sombreado metálico. - Poder de resolución unos 10 nm menor que el de transmisión.

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1.3. Microscopía electrónica. Observaciones de muestras en microscopía electrónica:

Las observaciones han de realizarse en el vacío, lo que impide hacer observaciones in vivo. - Los tejidos han de ser protegidos mediante fijación con: *glutaraldehído que estabiliza las moléculas proteicas y * tretraóxido de osmio que estabiliza las bicapas lipídicas. - Se deshidrata el tejido y se incluye en una resina plástica de epóxido para formar un bloque sólido. - Los cortes deben se muy finos, ultramicrotomo. - El contraste depende del número atómico de los átomos de la muestra, por lo que los cortes se exponen a sales metálicas pesadas (uranio, plomo, etc.) con el fin de aumentar el 26 Tema 1. Métodos estudio material biológico. contraste. Dra. Eva Mª García Vizcaíno [email protected]

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