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1º de Grado en Bioquímica

Tema 13: Metabolismo oxidativo

Tema 13: Metabolismo oxidativo. La mayor parte de los organismos son aerobios y oxidan sus combustibles orgánicos hasta CO2 y H2O, en la fase aerobia del catabolismo llamada respiración: C6H12O6 + 6O2 ® 6CO2 + 6H2O El metabolismo oxidativo ocurre en la mitocondria y se divide en tres fases principales: 1. Las moléculas combustibles orgánicas (azúcares, ácidos grasos, algunos aminoácidos) se oxidan para rendir fragmentos de dos átomos de carbono en forma de Acetil-CoA. 2. Estos grupos acetilo se incorporan al ciclo de Krebs o ciclo del ácido cítrico, donde se degradan enzimáticamente, hasta dar ATP, CO 2 y poder reductor en forma de NADH + H+ y FADH2. 3. Los nucleótidos reducidos producidos en este proceso se reoxidan cediendo sus e - y H+ a una cadena de proteínas oxidoreductasas transportadoras de electrones, que constituyen la cadena respiratoria o cadena de transporte electrónico, que conducen estos electrones hasta el oxígeno molecular para formar agua. Durante este proceso se libera una importante cantidad de energía que la célula aprovecha para sintetizar ATP en un proceso llamado fosforilación oxidativa.

FASE I: Formación de Acetíl CoA desde piruvato

El piruvato producido en el citoplasma en la glicólisis por la oxidación de la glucosa, puede atravesar la membrana mitocondrial externa gracias a proteínas llamadas porinas que permiten el paso a su través de un amplio rango de moléculas. Sin embargo, la membrana interna mitocondrial es una membrana impermeable a casi todas los metabolitos y éstos van a necesitar la acción de un transportador específico para poder introducirse en la matriz mitocondrial. El piruvato es introducido a la matriz mitocondrial por una proteína específica, piruvato translocasa (todavía no identificada). Una vez en el interior de la mitocondria será sustrato del complejo multienzimático piruvato deshidrogenasa. Éste son tres enzimas diferentes estructural y funcionalmente, pero que actúan de forma coordinada para que el proceso sea más eficiente. La piruvato deshidrogenasa es un enzima fundamental del metabolismo oxidativo, ya que va a ser la encargada de regular la entrada de piruvato (procedente de la oxidación de la glucosa) al metabolismo oxidativo (ciclo de Krebs (no pertenece a él)). El complejo multienzimático piruvato deshidrogenasa consta de tres enzimas (física y estructuralmente distintas pero asociadas físicamente), la enzima 1 es la piruvato deshidrogenasa cuyo grupo prostético es el pirofosfato de tiamina, la enzima 2 es la dihidrolipoil transacetilasa cuyo grupo prostético es el ácido lipoico, y por último la enzima 3 es la dihidrolipoil deshidrogenasa cuyo grupo prostético es el FAD; además para desarrollar su función el complejo multienzimático requiere la presencia de NAD+ y Co-A. (no le da demasiada importancia).

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Ciclo de Krebs: o Aunque la ruta es un ciclo, tiene gran flexibilidad, al igual que la ruta de las pentosas fosfato, dependiendo de las necesidades celulares. o

Tiene lugar en la mitocondria.

o Es una ruta anfibólica. Esto significa que puede ser tanto catabólica como anabólica. Si actúa catabólicamente se sigue el ciclo, si actúa anabólicamente algunos intermediarios se derivarán a rutas biosintéticas como síntesis de ácidos grasos, aminoácidos, o azúcares. o Muchos intermediarios pueden incorporarse al ciclo a través de una serie de rutas colaterales llamadas rutas anapleróticas. o La ruta consiste en la incorporación de dos átomos de carbono en forma de acetilCoA a una molécula de oxalacetato para formar citrato (6 átomos de C). Posteriormente, el citrato, tras una serie de reacciones, se convertirá de nuevo a oxalacetato (4 átomos de carbono) y se desprenderán dos moléculas de CO2. En el proceso se desprende gran cantidad de poder reductor.

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Las reacciones que conforman el ciclo de Krebs son las siguientes: 1ª Síntesis de citrato: la lleva a cabo la enzima Citrato Sintetasa que cataliza la condensación entre el grupo metilo del acetil-CoA y el grupo ceto del oxalacetato (OAA). La reacción es muy exergónica debido a la hidrólisis del enlace tioéster. Esta reacción es un punto regulador de la ruta.

2ª Formación de isocitrato: la lleva a cabo la enzima Aconitasa.

3ª Oxidación del isocitrato para dar α-cetoglutarato: la lleva a cabo la enzima Isocitrato deshidrogenasa y es un punto regulador de la ruta. En esta reacción se produce la primera descarboxilación (Pérdida de CO2).

4ª Oxidación del α-cetoglutarato para dar succinil-CoA: la lleva a cabo la α-cetoglutarato deshidrogenasa. Supone un punto de regulación de la ruta y la segunda descarboxilación. La αcetoglutarato deshidrogenasa es un complejo multienzimático análogo al de la PDH, con el mismo mecanismo de acción. La subunidad 1 es la α-cetoglutarato deshidrogenasa que tiene como grupo prostético pirofosfato de tiamina (TPP). La subunidad 2 es la dihidrolipoil transsuccinilasa que tiene como grupo prostético ácido lipoico, y la subunidad 3 es la dihidrolipoil deshidrogenasa que tiene como grupo prostético FAD, además el complejo requiere otras dos coenzimas, CoA y NAD+.

5ª Síntesis de succinato (molécula simétrica): la lleva a cabo la enzima succinil-CoA sintetasa y tiene como particularidad que la energía desprendida por acción de la rotura del enlace tioéster se emplea para sintetizar GTP en vez de ATP (por no se que pollas del centro activo).

6ª Oxidación del succinato a fumarato: la lleva a cabo la succinato deshidrogenasa.

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7ª Hidratación del fumarato a malato: la lleva a cabo la enzima fumarasa.

8ª Oxidación del malato a oxalacetato: la lleva a cabo la malato deshidrogenasa.

Balance final del ciclo de Krebs por una molécula de Acetil-CoA:

Al final del ciclo de Krebs vuelve a regenerarse la molécula de oxalacetato que puede volver a participar en el ciclo de Krebs. Regulación del ciclo de Krebs: El ciclo de Krebs tiene varios puntos de regulación entre los que destacan:  Piruvato deshidrogenasa: como ya hemos dicho antes la piruvato deshidrogenasa es una enzima alostérica, y la regulación de ésta es diferente dependiendo de la subunidad que se pretenda regular. 1.

2.

3.

La subunidad E1 del complejo, la piruvato deshidrogenasa, se regula de forma covalente, esto es, la subunidad E1 se encuentra inactiva cuando la piruvato deshidrogenasa quinasa introduce un grupo fosfato en un grupo hidroxilo de un determinado aminoácido de la subunidad, quedando de esta forma inactiva, para volver a activarla la piruvato deshidrogenasa fosfatasa mediante una molécula de agua extrae el grupo fosfato y regenera el grupo hidroxilo. La subunidad E2 del complejo, la dihidrolipoil transacetilasa se inhibe por la alta concentración de Acetil-CoA lo que evidencia un buen nivel energético celular que hace innecesario seguir formando Acetil-CoA para incluirlo en el ciclo de Krebs. Por consiguiente la molécula encargada de activar el funcionamiento de la dihidrolipoil transacetilasa es la CoA ya que una alta concentración de ésta indica baja concentración de Acetil-CoA, que es un indicio de una situación energética celular deficiente por lo que se requiere la formación de Acetil-CoA para conseguir energía mediante el ciclo de Krebs. La subunidad E3, dihidrolipoil deshidrogenasa, se inactiva por altas concentraciones de ATP y NADH+H+ debido a que esto indica un alto nivel energético, mientras que se activa por NAD + , ADP y AMP, indicadores de un pobre nivel energético.



Citrato Sintetasa la enzima citrato sintetasa es la enzima que cataliza la formación de citrato y su regulación es la siguiente. Esta enzima se ve inhibida por altas concentraciones de NADH, ATP, citrato y Succinil-CoA, ya que estas altas concentraciones evidencian que el nivel energético celular es suficiente y no es necesario seguir llevando a cabo el ciclo de Krebs, por el contrario esta enzima se activa cuando la concentración de AMP, ADP o NAD + es alta, hecho que evidencia la mala situación energética.



Isocitrato deshidrogenasa: la enzima Isocitrato deshidrogenasa se inhibe por altas concentraciones de ATP y NADH, que evidencian un nivel energético alto, y se activa por el aumento de las concentraciones de NAD+ y ADP.

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a-cetoglutarato deshidrogenasa (a-KGDH): este complejo enzimático es muy similar al complejo enzimático de la piruvato deshidrogenasa, y sus subunidades se regulan de forma casi idéntica. 1.

La subunidad E1 se regula de manera covalente al igual que la subunidad E1 de la piruvato deshidrogenasa. (preguntar)

2.

La subunidad E2 es una subunidad que presenta regulación alostérica ya que es inhibida por una alta concentración de Succinil-CoA ya que evidencia unos niveles energéticos celulares satisfactorios, mientras que es activada por el aumento de la concentración de CoA, indicio de una situación energética celular desfavorable.

3.

La subunidad E3 se ve inhibida por la alta concentración de NADH y ATP, indicadores de un alto nivel energético celular, y activada por la alta concentración de NAD+, AMP y ADP.

Rutas biosintéticas y anapleróticas del ciclo de Krebs: Los metabolitos del ciclo de Krebs cuando no es necesario seguir llevándolo a cabo hasta su totalidad, pueden ser empleados como precursores en rutas biosintéticas. Algunos de estos metabolitos son: •

Citrato: es transportado al citosol donde, por acción de la isocitrato liasa, es fragmentado a oxalacetato y acetil-CoA. Inicia la síntesis de ácidos grasos.

•

Oxalacetato y alfa-cetoglutarato: son los análogos cetoácidos de los aminoácidos aspártico y glutámico, respectivamente, y se utilizan en la síntesis de éstos y de otros aminoácidos.

•

Oxalacetato: inicia la biosíntesis de azúcares.

•

Succinil-CoA: se utiliza en la síntesis del grupo hemo y otras porfirinas.

Por otro lado, las rutas anapleróticas son necesarias para reponer los intermediarios del ciclo de Krebs que han sido utilizados con fines biosintéticos.

Parte II del tema: Lanzaderas metabólicas: Son sistemas de transporte de poder reductor a través de la membrana interna mitocondrial, cuya función es la de introducir el poder reductor generado en procesos catabólicos como la glicólisis que se llevan a cabo en el citoplasma, ya que las coenzimas de óxido-reducción que los transportan no son capaces de atravesar la membrana interna mitocondrial. Cabe destacar dos tipos de este mecanismo de introducción del poder reductor en la matriz mitocondrial: Lanzadera del glicerol/fosfato: se lleva a cabo mediante la incorporación de los electrones y protones del NADH+H+ a la molécula de dihidroxiacetona fosfato mediante la enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa citoplasmática, Este glicerol-3-fosfato será sustrato de la enzima glicerol-3-fosfato de la membrana interna mitocondrial, que tiene como grupo prostético el FAD que será el receptor de los protones y electrones transportados por la molécula de glicerol-3-fosfato, que al desprenderse de ellos volverá a transformarse en una molécula de dihidroxiacetona fosfato. Se da en músculo esquelético y cerebro.

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Lanzadera del malato/aspartato: se lleva a cabo en mediante la incorporación de los electrones y protones del NADH+H+ que son transferidos a la molécula de oxalacetato, transformándose en malato que entrará mediante el transportador de malato/α-cetoglutarato hasta la matriz mitocondrial donde se desprenderá de sus protones y electrones que serán captados por el NAD+ transformándose el malato en oxalacetato que mediante una aminotransferasa ganará un grupo amino procedente de una molécula de glutamato, que a su vez se transformará en α-cetoglutarato que será extraído de la matriz mitocondrial mediante el transportador del malato/α-cetoglutarato. El oxalacetato al captar el grupo amino se transforma en aspartato que saldrá de la matriz mitocondrial por acción del transportador de aspartato/glutamato, una vez en el espacio intermembrana el aspartato se desprenderá del grupo amino por acción de una aminotransferasa que se lo cederá a la molécula de α-cetoglutarato, convirtiéndose éste en glutamato que será introducido a la matriz mitocondrial por el transportador de aspartato/glutamato. Mientras tanto el aspartato al perder su grupo amino se transforma en oxalacetato que puede volver a captar los protones y electrones del NADH+H+ y volver a convertirse en malato dando continuidad a la entrada del poder reductor a la matriz mitocondrial.

FASE III: CADENA DE TRANSPORTE ELECTRÓNICO Y FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. En las reacciones de oxido-reducción los electrones son transferidos desde un dador electrónico (agente reductor) hasta un aceptor de electrones (agente oxidante). Los e - pueden ser transferidos de una molécula a otra mediante uno de estos tres mecanismos: o Directamente como electrones. Por ejemplo, el par redox Fe 2+ ® Fe3+ puede transferir un electrón al par Cu+ ® Cu2+: Fe2+ + Cu2+ ® Fe3+ + Cu+ Pueden transferirse e - en forma de átomos de hidrógeno. Un átomo de H está constituido por 1H+ y 1e-: AH 2 + FAD ® A + FADH2

o

o

Los e- pueden transferirse como iones hidruro (H-): NADH + H+ + A ® AH2 + NAD+

Cada par conjugado redox posee un potencial de óxido-reducción característico E’º. La tendencia de un par redox conjugado a perder su e - viene dada por el valor de su potencial de óxido reducción. A estos potenciales de óxido reducción se les asigna valores cada vez más negativos cuanto mayor sea la tendencia a ceder electrón, y valores cada vez más positivos a los sistemas que tienen una tendencia a captar electrón. Así, los pares redox con Eº’ negativos tienden a ceder su e - a sistemas con valores de Eº’ más positivos. Los potenciales de óxido reducción se miden en voltios o milivoltios.

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Las transferencias de electrones van acompañadas de variaciones de energía libre. En las reacciones de transferencia de electrones hay que tener en cuenta: 1- Los e - no fluyen de un par redox a otro a no ser que esté presente un catalizador o enzima que acelere el proceso. 2- El catalizador no altera la dirección del flujo ni el equilibrio final. 3-La tendencia de los e- a fluir de los sistemas electronegativos a los electropositivos da como resultado una pérdida de energía libre, ya que los e - siempre se desplazan en la dirección en la que disminuye la energía libre del sistema. Cuanto mayor sea la diferencia entre los Eº’ de los dos pares redox mayor será la pérdida de energía libre. DGº y Eº’están relacionadas mediante la ecuación: DGº’ = - n F DEº’ donde: n= número de electrones que se transfieren. F= Constante de Faraday= 23062 cal/(vol*mol). DEº’= Diferencia entre el Eº’ aceptor – Eº’ dador. Síntesis de ATP gracias a la cadena de transporte electrónico y a la fosforilación oxidativa: La mayor parte del ATP que se produce en la oxidación aerobia de la glucosa se origina gracias a dos procesos independientes pero acoplados, que son: 1.- Por un lado, los NADH y FADH 2 producidos en la glicólisis y C. de Krebs son nuevamente oxidados a NAD + y FAD, al ceder éstos sus e - y H+ a una cadena transportadora de electrones que conduce estos e- desde el NADH o FADH2 al oxígeno molecular para formar H2O. Esta cadena transportadora de e - es un sistema de proteínas localizadas en la membrana mitocondrial interna de las células eucariotas y en la membrana plasmática de procariotas. Son oxido-reductasas con capacidad de, a la vez que transportan e -, bombear H+ al espacio intermembrana, generando un gradiente de H+ a través de la membrana mitocondrial interna. 2.- El gradiente de H+ es una fuente de energía libre (fuerza protomotriz), que es utilizada por una proteína de la membrana interna mitocondrial, la ATP sintetasa, para fosforilar ADP y formar ATP en un proceso que se llama Fosforilación Oxidativa. Cadena de transporte electrónico: La cadena de transporte electrónico se compone de un conjunto de proteínas oxidoreductasas, cuya función es la transferencia de electrones, entre las cuales tenemos: -Deshidrogenasa del NAD+: Tiene como grupo prostético FMN. Acepta los e- y H+ del NADH. -Ubiquinona: Acepta 2e- y 2H+ procedentes del FADH2. -Citocromos: Presentan como grupos prostético grupos similares al hemo, con enlaces de coordinación con Fe 2+. Sólo transportan electrones. Tres tipos: o Citocromo b. o Citocromo c. o Citocromo aa3.

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Los electrones y protones transportados por el NADH+H + son cedidos al primer complejo de la cadena de transporte electrónico, la deshidrogenasa del NAD, y serán transferidos de un complejo de la cadena a otro hasta llegar ser cedidos finalmente al oxígeno molecular que reaccionará con los protones formando agua. En el paso de los dos electrones cedidos por el NADH por los complejos I, III y IV se bombea un protón al espacio intermembrana por cada electrón que pasa, esto supone que los dos electrones del NADH provocan el bombeo de 6 protones a lo largo de su tránsito por los complejos de la cadena de transporte electrónico, mientras que los del FADH2 que son cedidos al complejo dos solo producirán el bombeo de 4 protones, 1 por cada electrón liberado al atravesar dichos e - los complejos III y IV. Estos protones bombeados al espacio intermembrana suponen una fuerza protomotriz debido al gradiente de la concentración de protones a ambos lados de la membrana interna mitocondrial que será empleada en la fosforilación oxidativa. Fosforilación oxidativa: Los protones del gradiente de protones creado en la cadena de transporte electrónico se aprovecharán en la síntesis de ATP por medio de la ATP-sintetasa cuando éstos vuelvan a entrar al interior de la matriz mitocondrial. La ATP-sintetasa se encuentra coordinada con otras dos enzimas localizadas en la membrana mitocondrial interna: la ADP/ATP-translocasa y la fosfato translocasa.

Esta ATP-sintetasa es capaz de fosforilar un ADP hasta ATP por cada dos protones que vuelven a entrar en la matriz. De este modo, por cada NADH+H + se pueden obtener 3 moléculas de ATP, mientras que por cada FADH2 se obtienen solo dos moléculas de ATP debido a que los electrones del FADH 2 son cedidos en el complejo 2, y no en el 1 como los del NADH+H +. El acoplamiento de la cadena de transporte electrónico y la fosforilación oxidativa es explicado por la hipótesis quimiosmótica. Existen ocasiones en las que es necesario generar calor antes que producir ATP. En estos casos entran en juego los agentes desacoplantes que son capaces de disipar la fuerza protomotriz del gradiente de protones en forma de calor, a la vez que permiten el funcionamiento de la cadena de transporte electrónico. Esto se produce debido a que estos agentes desacoplantes, como es el caso del 2,4dinitrofenol captan los protones y como son capaces de atravesar la membrana interna mitocondrial entran al interior de la matriz mitocondrial por gradiente de concentración, menor en la matriz, de modo que los protones vuelven a ser introducidos en la matriz mitocondrial sin ser empleados por la ATPsintetasa de modo que no se sintetiza ATP. Este desacoplamiento de la fosforilación oxidativa tiene funciones fisiológicas en las que participan las proteínas desacoplantes (UCP), que se encuentran en las mitocondrias y se activan en situaciones fisiológicas en las que se necesita ma...