TEMA 9 metabolismo. Fotofosforilación PDF

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Apuntes detallados de clase y completados con bibliografía (Matthews, Lehninger).
PROFESOR: Manuel González...

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Apuntes Metabolismo – Adrián Sánchez

TEMA 9: FOTOFOSFORILACIÓN Fotosíntesis En su versión más simple, la fotosíntesis requiere luz solar, agua, dióxido de carbono y se obtiene glucosa y oxígeno. Esto solo ocurre en el caso de plantas y cianobacterias. No obstante, el donador de electrones en lugar de agua puede ser el sulfhídrico, tiosulfito, hidrógeno, metano… En esencia, consiste en usar luz para obtener energía y poder reductor. En la fase oscura, se emplea la energía y poder reductor para obtener carbohidratos, azufre orgánico, nitrógeno orgánico… En las plantas superiores esto ocurre a nivel de los cloroplastos, concretamente a nivel tilacoidal. Los tilacoides se apilan formando estructuras denominadas grana. En la membrana tilacoidal es donde van a encontrarse los pigmentos fotosintéticos y los complejos encargados de llevar a cabo la fotofosforilación. A diferencia del NADH, el agua es un donador pobre de electrones, por lo que se requiere energía externa en forma de luz para crear un buen donador de electrones. En la fotofosforilación, los electrones fluyen a través de una serie de transportadores unidos a la membrada, incluyendo citocromos, quinonas, proteínas Fe-S, mientras que los protones son bombeados a través de la membrana para crear un potencial electroquímico

FASE LUMINOSA. SISTEMAS DE ABSORCIÓN DE ENERGÍA Para la absorción son necesarios una serie de pigmentos: (el componente que absorbe luz se llama cromóforo) -

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Clorofila: son pigmentos verdes con una estructura de anillo tetrapirrólico con un magnesio en el centro coordinado con cuatro nitrógenos. Además, tiene una cadena de fitol de tipo isoprenoide (que como la del coenzima Q se obtiene a partir de acetil-CoA). Esta cadena hidrofóbica ancla la clorofila a los lípidos. Al igual que los grupos hemo, hay distintas clorofilas en función de las modificaciones del anillo tetrapirrólico. Los cloroplastos siempre poseen clorofila a y clorofila b con diferentes espectros de absorción (dentro del verde). Β-carotenos: es un isopreno modificado. Ficocianinan y ficoeritrinas: los anillos tetrapirrólicos adquieren una estructura lineal.

Todos estos tipos tienen en común la presencia de dobles enlaces conjugados que permiten estabilizar los electrones por resonancia, deslocalizándolos por toda la molécula y permitiendo que sean más estables estas moléculas (y antioxidantes). En el organismo suele haber varios tipos de pigmentos. Cada uno absorbe a distinta longitud de onda para poder utilizar la mayor parte del espectro visible.

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Las membranas tilacoidales contienen relativamente pocos fosfolípidos, pero muchos glucolípidos y proteínas. Algunos de los pigmentos fotosintéticos están asociados a estas proteínas. Otros, como las clorofilas, no están unidas covalentemente sino que interaccionan tanto con proteínas como con lípidos de membrana (a través de las colas de fitol). Los pigmentos captadores de luz y sus proteínas se asocian en fotosistemas bien definidos, cuya función es absorber fotones de la luz y transformar parte de su energía en energía en energía química. Las plantas tienen dos fotosistemas. La energía es recogida por los fotosistemas, concretamente por complejos recolectores de luz o light harvesting complexes (LHC) que hay asociados. Cada LHC es un complejo de múltiples subunidades que contiene pigmentos antena (clorofilas y alguna proteína accesoria), y un par de moléculas de clorofila que actúan como centro de reacción, atrapando la energía resultante de la excitación de la luz. En el caso de las cianobacterias la estructura es distinta, aparecen laos ficobolisimas donde la ficoeritrina y la ficocianina están orientadas para dirigir la luz a la clorofila del centro de reacción. También aparecen en algas rojas. Cada molécula tiene distintos niveles de excitación, de tal manera que los electrones pueden pasar a niveles de excitación superior cuando absorbe luz. De forma normal, esta energía se disiparía como calor o fluorescencia y la molécula volvería a su estado basal. Sin embargo, si junto a una molécula excitada se coloca otra molécula no excitada pero con orbitales de idéntica energía a nanómetros de distancia, los fotones pueden saltar a la molécula adyacente y se excita cuando decae la primera con una pérdida mínima de energía. Realmente es porque las nubes electrónicas se combinan. Es lo que se denomina una transferencia por resonancia o transferencia de excitones. Si la molécula adyacente tiene un estado de excitación algo menor, en lugar de transferirse un fotón, se transfiere un electrón. Ambos procesos se dan en la fotosíntesis. Los pigmentos transmiten el fotón de forma aleatoria (movimiento browniano) por todos los pigmentos del complejo antena hasta llegar a las dos clorofilas del centro de reacción, donde como el nivel energético es ligeramente menor, se cede un electrón (lo que lleva unos 0,1 ns). Es decir, en los pigmentos antena ocurre la transferencia por resonancia y en el centro de reacción se transmite el electrón (mayor energía), porque el entorno proteico determina que el estado energético sea ligeramente menor. Con esto se consigue minimizar la pérdida de energía por fenómenos como la fluorescencia.

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Como resultado, el centro de reacción pierde un electrón iniciando la CTE y por lo tanto va a tener que recuperarlo. En el caso de las plantas, se recupera del agua. La pérdida del electrón es recuperada por la donación de un electrón por un donador de electrones adyacente, que pasa entonces a tener carga positiva (mientras que el aceptor ahora está cargado negativamente). Esto provoca la separación de cargas que inicia un proceso de oxido-reducción.

Los electrones pasan de un fotosistema II a una plastoquinona, de ahí a un citocromo b6f, a una plastocianina, fotosistema I, ferredoxina y van a ser aceptados por un NADP. La plastoquinona se encuentra embebida en la membrana tilacoidal y la plastocianina se encuentra en el lumen del tilacoide. Desde un punto de vista de potencial redox, es necesaria la incidencia de luz a nivel de los dos fotosistemas para elevar los electrones a un estado de excitación suficientemente alto para ser capaz de reducir al NADP.

COMPLEJOS ANTENA Las antenas están formadas por unas 250 moléculas de clorofila orientadas para que la transferencia de energía sea rápida y se aproveche el 99% de la luz incidente. La clorofila b sólo se encuentra en la antena; la a en la antena y el centro de reacción. Se han identificado 15 proteínas LHC en PSI (LHCI) y otras 15 en PSII (LHCII). Son proteínas de 20-30 KDa. LHCII es exclusiva de las membranas de los grana. Cuando se fosforila se hace más negativa y se desplaza desde el core hidrofóbico de los grana a membranas menos hidrofóbicas más expuestas al estroma, l que causa una disminución de la captación de luz por PSII. La fosforilación es mediada por una quinasa activada por el balance redox o por el incremento del pool de pQ reducida. Esto es revertido por una fosfatasa. (explicado en la parte de regulación).

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FASE LUMINOSA. TRASFERENCIA DE ELECTRONES En la transferencia de electrones participan: 1. Tres complejos proteícos: PSII, citocromo b6/f y PSI 2. Tres transportadores electrónicos móviles: plastoquinona, plastocianina (lumen) y ferredoxina (estroma). 3. Enzima ligada a la cara del estroma del tilacoide: ferredoxina:NADP+ reductasa. En cada fotosistema, el paso principal es la transferencia de un electrón excitado por la luz desde el centro de reacción (P680 o P700) a una CTE. La fuente de electrones es el agua y su destino es NADP+. En esta CTE se bombean protones al lumen creando un gradiente que lleva a la producción de ATP.

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Fotosistema II En el fotosistema II se distinguen las dos clorofilas del centro de reracción, en este caso el p680. Al excitarse, se convierte en un agente reductor, transfiriendo los electrones a feofitinas (anillos tetrapirrólicos sin magnesio en el centro). Posteriormente se ceden a la plastoquinona A, a la plastoquinona B y en último lugar a la plastoquinona que pasa a plastoquinol. Se transfieren dos electrones, y dos protones se obtienen del estroma. La plastoquinona funciona igual a la ubiquinona, con una forma semiquinona y una forma quinol. Los electrones de la plastoquinona van al citocromo b6f.

Citocromo b6f Cataliza la transferencia de electrones desde el plastoquinol hasta la plastocianina, que tiene un cofactor Cu 2+ (acepta un electrón porque no hay cobre metálico). Esto supone un problema porque el plastoquinol cede dos electrones y la plastocianina acepta solo un electrón por lo que en este caso también se da un ciclo Q. Los componentes principales son el citocromo f (que tiene un hemo c), el citocromo b6 (que tiene dos hemos b) y una proteína Fe-S de Rieske. Al igual que en el complejo III, el paso de los electrones por el citocromo b6f también hay un bombeo de protones, en este caso hasta el lumen del tilacoide. PC a su vez es una proteína móvil en el lumen del tilacoide, y pasa los electrones a los centros de reacción P700 en PSI.

Regeneración del fotosistema II El fotosistema II se regenera por los electrones liberados en la oxidación del agua (en el caso de la fotosíntesis oxigénica). Por cada dos fotones absorbidos (uno por cada fotosistema), un electrón se transfiere del agua al NADP+. Para la producción de un oxígeno se necesitan 2 moléculas de agua (4 electrones) que se transfieren a 2NADP+, por lo que la excitación necesaria para el movimiento electrónico será de 8 fotones.

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Además, la salida del oxígeno va a ser directamente en forma de oxígeno molecular, por lo que el mecanismo es muy complejo para evitar que se libere oxígeno libre. De hecho, aún no se conoce al detalle. El donador de electrones de PSII es una subunidad llamada complejo generador de oxígeno (OEC). Esta proteína tiene un cluster de 4 Mn (II) unidos por oxígenos y 1 Ca (II), que puede existir en varios estados de oxidación. El radical clorofila P680+ oxida la tirosina Yz cerca del OEC. -

NO ENTRA EN EL EXAMEN: el fotosistema II tiene una compleja estructura. En él se encuentra el complejo generador de oxígeno, con una estructura en la que aparecen oxígenos formando enlaces con manganeso y aparece un calcio distorsionando la estructura. Aparecen además una tirosina y una histidina conservada que sirve para posicionar la molécula de agua alrededor de este grupo. Es complicado determinarlo ya que es muy sensible a la cantidad de electrones que hay (si se quiere estudiar por difracción de rayos X previa cristalización de las proteínas). No obstante, usando lásers se puede controlar una longitud de onda específica, permitiendo mejorar los datos que se obtienen de difracción de rayos X ya que hay menos dispersión. Con microscopía electrónica, aunque se puede bajar la resolución a la mitad de la longitud de onda del electrón, no se pueden ver los enlaces porque en el vacío la estructura deshidratada se daña. Otra forma de resolver la estructura es con criomicroscopía electrónica, donde se congela muy rápidamente a altas presiones para evitar la formación de cristales. Controlando la energía de los rayos X con los que se daba el pulso y la forma de congelación de la muestra, se pueden observar moléculas concretas. Otra forma de determinar la estructura es por RMN pero para una proteína es un problema, aunque se arregle con selenocisteína. Moléculas de gran tamaño giran demasiado rápido y el giro crea interferencias que complica demasiado el análisis.

Hay una serie de canales en el fotosistema por donde se cree que entra el agua y sale el oxígeno. El complejo sigue un patrón secuencial, es decir, el avance cíclico a lo largo de estos estados de oxidación es movido por la luz y permite desmontar dos moléculas de agua y pasar 4 electrones a P680, liberando 4 protones al lumen del tilacoide. El primer fotón llega a p680 y pierde el electrón, por lo que lo recupera del complejo generador de oxígeno que pierde uno, pierde el segundo, se une la primera molécula de agua, pierde el tercer electrón, el cuarto, se une la segunda molécula de agua y se libera finalmente el oxígeno.

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Fotosistema I El fotosistema I con los fotones se excita en el centro de reacción P700 y cede electrones, por lo que los recupera de la plastocianina. Los electrones excitados pasan por una CTE primero por la clorofila aceptora (A0), y luego a filoquinona (vitamina K1 o A1) y luego pasa por 3 proteínas Fe-S. Finalmente los electrones pasan a la ferredoxina (Fd) soluble en el estroma. La ferredoxina es una proteína con clúster Fe-S y acepta los electrones procedentes de la plastocianina. Posteriormente la ferredoxina transfiere los electrones a distintos aceptores. Lo más normal es que se los transfiera a NADP que pasan a NADPH. Esto está mediado por la ferredoxín-NADP reductasa (FNR). No obstante, no es necesario que esto ocurra, ya que a veces los electrones de la ferredoxina son desviados para reducir otros compuestos.

Generación de ATP El bombeo de protones y los protones que se liberan del agua al espacio tilacoidal permiten generar un gradiente quimioosmótico. Cuando estos protones salen del tilacoide por la ATP sintasa se obtiene ATP. Se estima que 1 ATP se produce por 3 protones pasando por la ATP sintasa del cloroplasto y que 1 mol de oxígeno se produce por cada 12 moles de protones transportados.

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Fotofosforilación cíclica Cuando no se quiere seguir produciendo NADPH, la ferredoxina en lugar de ceder los electrones a la Fd:NADP oxidorreductasa, se los pasa a la plastoquinona y de ahí al citocromo b6f, para conseguir bombeo de protones y por lo tanto una producción continua de ATP pero no de NADPH. Posteriormente pasan a la plastocianina y de ahí al centro P700 que se los vuelve a transferir a la ferredoxina. No hay tampoco liberación de oxígeno.

Regulación de la fase luminosa El fotosistema II cede los electrones a la plastoquinona de forma mucho más rápida de lo que el fotosistema I puede aceptarlo de la plastocianina ya que la capacidad oxidativa del PSII es mayor que la del PSI. Si el fotosistema II está en continua estimulación, se acumula tanto plastoquinol que se va a perder luz, porque no puede seguir produciéndose NADPH o ATP. Es decir, la limitación del aprovechamiento de luz depende de la velocidad del flujo electrónico. Esto además es un problema porque causa daño oxidativo y es una fuente de estrés. Para solucionarlo, la distribución de los fotosistema es asimétrica. El interior de las membranas de los grana son ricos en PSII y las láminas del estroma son ricas en PSI. Los complejos antena (LHCII) en condiciones normales son integrales de membrana y además están unidos a la membrana de otro grana. Esto evita la difusión del complejo antena porque la estructura es más rígida (está anclado). Cuando se acumula mucho plastoquinol por recibir mucha luz, es necesario disminuir la velocidad del fotosistema II y aumentar la del I. Para ello, el LHCII se va a separar del fotosistema II, para que tenga menos sistemas captadores de luz y por lo tanto pasen menos electrones al plastoquinol. Esto se consigue cuando el LHCII se fosforila en una treonina por una quinasa y se desancla. Esto permite difundir la proteína en la bicapa y separarse del fotosistema II, por lo que el fotosistema II al tener menos complejos antena, acepta menos fotones y se produce menos plastoquinol. Además va a desplazarse hacia el fotosistema I con el que se asocia, que pasa a tener más complejos captadores de luz y por lo tanto va a funcionar más rápido de lo que funcionaba antes, pasando más electrones de la ferredoxina y pudiendo recibir más electrones de la plastocianina. Es decir, LHCII fosforilado redirecciona la energía absorbida a PSI a expensas de PSII. En condiciones en las que el pool de PQ se oxida, se desactiva la quinasa y una fosfatasa constitutivamente activa defosforila LHCII que vuelve a PSII.

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Se soluciona así el cuello de botella que se formaba a nivel del plastoquinol.

Respiración y fotosíntesis en cianobacterias Ambos procesos comparten la plastoquinona, el citocromo b6f (complejo III) y el citocromo c. Lo que cambia son el PSII y el PSI y el complejo I y IV, pero el resto funciona exactamente igual. Es decir, primero apareció la fotosíntesis y posteriormente la cadena transportadora de electrones.

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De hecho, si los niveles de cobre bajan, la planta expresa un citocromo c en el cloroplasto que sustituye funcionalmente a la plastocianina, aceptando los electrones del complejo b6f (análogo del complejo III). El Cu+ es más insoluble que el Cu2+. Cuanto aumentó la cantidad de oxígeno, se empezó a usar plastocianina con Cu pero los fotosistemas antiguos (cianobacterias) usan un citocromo con hierro. Es decir, el hierro es la forma ancestral....