Tema 4 - Centrifugación PDF

Preview

Summary

Apuntes completos, limpios e ilustrados de Bioquímica Experimental I. Profesor: Fernando Publio Molina....

Description

Tema 4: Centrifugación •

• • •

4.1. Fundamentos • Sedimentación por gravedad • Centrifugación o Fuerza centrífuga relativa (FCR) o Velocidad de sedimentación (vs) o Coeficiente de sedimentación (S) 4.2. Tipos de centrífugas 4.3. Tipos de rotores 4.4. Tipos de centrifugación • Centrifugación diferencial • Centrifugación zonal • Centrifugación isopícnica o Centrifugación en gradientes: zonal e isopícnica • Centrifugación analítica

4.1 Fundamentos Según el principio de Arquímedes, una bola de acero se hunde en el agua al ser más densa que ella. La mantequilla es mucho menos densa que el agua, pero una bola de acero no se hundiría en ella. Esto se debe a que también existe una fuerza de rozamiento que debe ser vencida; para ello se utiliza la centrifugación, que aumenta el efecto de la gravedad para vencer dicha fuerza de rozamiento. La centrifugación es una técnica de sedimentación acelerada y de separación de sustancias de diferente densidad, gracias al uso de la fuerza centrífuga. En esto influyen: • •

Las propiedades físicas de la muestra (forma, tamaño y densidad). La viscosidad de la solución en la que se encuentra la muestra.

Dos tipos de técnicas: • •

Centrifugación preparativa: aísla partículas específicas. Centrifugación analítica: se estiman propiedades físicas hidrodinámicas de alguna partícula.

4.1.1. Sedimentación por gravedad Cuando la densidad de la partícula (ρ) es mayor que la densidad del disolvente (ρo), se produce la sedimentación por gravedad.

Suponiendo que ρ es mayor que ρ0, la fuerza total es: 𝐹𝑇 = (𝐹𝑅 + 𝐸) − 𝑃 Y en el equilibrio: 𝐹𝑅 + 𝐸 = 𝑃 → 𝐹𝑅 = 𝑃 − 𝐸 La velocidad será constante: 𝑓 · 𝑣𝑠 = 𝜌𝑉𝑔 − 𝜌0 𝑉𝑔 = (𝜌 − 𝜌0 )𝑉𝑔 𝑣𝑠 =

(𝜌 − 𝜌0 )𝑉𝑔 𝑓

La velocidad de sedimentación (vs): • Es proporcional al tamaño de la partícula, a su densidad y a la densidad del medio. • Es nula cuando las dos densidades son iguales. • Disminuye al aumentar la viscosidad del medio.

4.1.2. Centrifugación En la centrifugación se produce la separación de partículas que basada en la distinta velocidad de desplazamiento de las partículas en un medio líquido al ser sometidas a un campo centrífugo. Para calcular la gravedad efectiva en una centrífuga: 𝑃𝐸 = 𝑃 + 𝐹𝑐 = 𝑚 · (𝑔 + 𝑎𝑐 ) 𝑃𝐸 = 𝑚 · 𝑔𝐸 𝑔𝐸 = √𝑔2 + 𝑎𝑐 2 𝑎𝑐 = 𝜔2 · 𝑟 𝑔𝐸 = √𝑔2 + (𝜔 2 · 𝑟)2 Si 𝑔 es mucho menor que 𝜔2 · 𝑟, entonces se puede despreciar dicha 𝑔 (en una centrifugación, la fuerza de la gravedad es minúscula comparada con la aceleración centrífuga), quedando: 𝑔𝐸 = 𝜔2 · 𝑟 Para calcular la velocidad de sedimentación (vs), primero definimos el empuje efectivo: 𝐸 ′ = 𝜌0 𝑉𝑔𝐸 Siendo 𝐸’ el empuje efectivo. Sabiendo que 𝑉 = 𝑚/𝜌, entonces: 𝐸′ = (

𝜌0 ) 𝑚𝑔𝐸 𝜌

Por otra parte, el peso efectivo 𝑃𝐸 : 𝑃𝐸 = 𝐹′𝑅 + 𝐸′ 𝑚𝑔𝐸 = 𝑓𝑣𝑠 + ( 𝑓𝑣𝑠 = 𝑚𝑔𝐸 − (

𝜌0 𝜌

) 𝑚𝑔𝐸

𝜌0 ) 𝑚𝑔𝐸 𝜌

𝜌 𝑚𝑔𝐸 (1 − 𝜌0) 𝑣𝑠 = 𝑓 𝑣𝑠 =

𝑚𝜔2 𝑟 (1 − 𝑓

𝜌0 ) 𝜌

La velocidad de sedimentación (vs) es proporcional a la masa de la partícula. Para aumentar vs se aumenta la velocidad angular (ω). La velocidad de sedimentación es útil para caracterizar partículas, pero en bioquímica se emplea otra unidad: el coeficiente de sedimentación (S), que es la velocidad de sedimentación por unidad de fuerza centrífuga. Es una constante característica de cada orgánulo o macromolécula y sus unidades se dan en Svedbergs, nombre de su descubridor. Así: 𝜌 𝑚𝜔2 𝑟 (1 − 𝜌0 ) 𝑣𝑠 = 𝑓 𝜌 𝑚 (1 − 𝜌0 ) 𝑣𝑠 = 𝑓 𝜔2𝑟 𝜌 𝑚 (1 − 0) 𝑣𝑠 𝜌 𝑆= 2 = 𝑓 𝜔 𝑟 Si asumimos que 𝑉 = 𝑚/𝜌 ≈ 1/𝜌: 𝑆=

𝑚(1 − 𝜌0 𝑉) 𝑣𝑠 = 𝜔2𝑟 𝑓

Un Svedberg (S) equivale a 10-13 segundos. Existen determinados factores que lo afectan: •

• •

•

•

•

Temperatura: afecta a dicho coeficiente puesto que modifica la viscosidad del disolvente. Por tanto, se suele hablar de un coeficiente de sedimentación a una temperatura determinada. Si no pone nada, son condiciones estándar. Masa: a mayor masa, mayor coeficiente de sedimentación. Forma: El coeficiente de sedimentación es inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f). Mientras mayor sea la superficie de la partícula, mayor será la fricción provocada. Para una partícula esférica no hidratada: 𝑓0 = 6 · 𝜋 · 𝜂 · 𝑟0 Grado de solvatación: también puede modificar el coeficiente de sedimentación puesto que se pueden formar cristales alrededor que aumenten el tamaño efectivo de la molécula y por tanto su rozamiento. Concentración: el coeficiente de fricción aumenta a medida que aumenta la concentración, provocando la disminución del coeficiente de sedimentación. No obstante, también puede provocar alteraciones según las moléculas formen agregados, aumentando la masa específica de las moléculas y por tanto aumentando el coeficiente de sedimentación. Carga: modifica el grado de solvatación, por lo que también puede afectar al coeficiente de sedimentación.

En la gráfica de la derecha se compara la variación del coeficiente de sedimentación según se modifique la concentración de la muestra. El coeficiente de sedimentación de una molécula extendida, como el ARN, decrece rápidamente conforme aumenta la concentración, ya que es más probable que interaccionen entre ellos y causen fricción. En una proteína compacta con poca superficie, como la albúmina de suero bovino, el aumento de concentración tiene poco efecto sobre su coeficiente de sedimentación, ya que debido a su pequeño tamaño es difícil que las moléculas interactúen entre sí y se ocasionen fricción. Por último, el coeficiente de sedimentación de la glicerofosfato deshidrogenasa aumenta conforme aumenta la concentración, debido a que forma agregados los cuales tienen una masa mayor que las moléculas por separado, de manera que sedimentan más rápido.

4.2 Tipos de centrífugas Las centrifugas se clasifican según su velocidad de rotación y por las veces que supera la fuerza de la gravedad. • •

•

Centrífugas (de pocas g hasta aprox. 3.000 g). Super-Centrífugas (o centrífugas de alta velocidad) (intervalo de 2.000 g a 20.000 g). En estas centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción con las partículas de aire. Ultracentrífugas (de 15.000 g a 600.000 g). En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100.000 r.p.m.) hace que sea necesario además de la refrigeración hacer un intenso vacío en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra.

4.3 Tipos de rotores •

•

Rotor de ángulo fijo. Los tubos se insertan en orificios en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el de los rotores verticales en los que el tubo se sitúa paralelo al eje de giro. Este tipo de rotores es típico de supercentrífugas y se emplea en la sedimentación de partículas y en la centrifugación isopícnica. La centrifugación se lleva a cabo siempre en un ángulo fijo respecto al eje. Rotor basculante. Los tubos se colocan en un dispositivo (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en disposición perpendicular al eje de giro. Separaciones de moléculas en gradientes de densidad autogenerados.

Los rotores de ultracentrífugas son siempre de titanio, es lo único que puede resistir la fuerza ejercida. Los rotores verticales sirven para hacer gradientes de densidad.

Las imágenes adjuntas muestran los diversos tipos de rotor, y la posición de los sedimentos tras la centrifugación en cada uno de ellos.

4.4. Tipos de centrifugación •

•

Preparativa: para aislar partículas específicas. o Diferencial: Muestra homogénea. Se realiza una separación entre sobrenadante y precipitado. La separación es por tamaño. o Zonal: Separa la muestra en bandas. El gradiente de densidad debe haber sido formado antes de la centrifugación, con la muestra encima. La separación producida es según el coeficiente de sedimentación S. o Isopícnica: Muestra homogénea. El gradiente de densidad se genera durante la centrifugación, produciéndose una separación en bandas según la densidad, ya que los solutos se sitúan en las zonas donde el disolvente tiene la misma densidad que ellos. Analítica: para estimar propiedades físicas de las partículas.

[Dato: Dos disoluciones con una diferencia de densidad significativa no se mezclan espontáneamente a menos que se agiten].

4.4.1. Centrifugación diferencial En este tipo de centrifugación, las partículas más grandes caen primero porque tienen una relación superficie/volumen menor; es decir, se dirigirán hacia el fondo del tubo según su tasa de sedimentación. El sedimento creado, también llamado pellet, estará enriquecido en las partículas que más rápido sedimenten. Es un método útil para el aislamiento de células y orgánulos, separación de proteínas mediante precipitación con sulfato amónico, tratamiento térmico, … Es importante señalar que es un método de enriquecimiento, no de purificación, puesto que no se consigue un producto puro, sino enriquecido, ya que seguirá conteniendo otras sustancias no deseadas.

4.4.2. Centrifugación zonal o en bandas En la centrifugación zonal, hay un punto en el que el soluto no avanza más debido a la densidad de la solución. Es decir, se crean zonas artificialmente y las moléculas se pondrán en la interfase entre las diferentes zonas según su densidad. Esto la diferencia de la isopícnica, donde las moléculas se colocan en su punto exacto de densidad. Los tipos de gradiente que podemos tener son:

Para hacer un gradiente discontinuo, se pueden añadir las sucesivas capas desde arriba (la superficie) o desde el fondo del tubo. Realizar un gradiente continuo es más difícil, pudiendo formarse con estos métodos:

Para coger la fracción que queramos del tubo centrifugado por zonas, se puede usar una jeringuilla y pincharse por un lado si el tubo es de material blando o desde arriba si no es de vidrio. Otros métodos más precisos:

Para ver ejemplos de tubos tras centrifugación zonal, consultar diapositivas.

Las centrifugaciones zonal e isopícnica siempre se hacen en rotores basculantes para que no se distorsione el gradiente.

4.4.3. Centrifugación isopícnica Este tipo de centrifugación provoca una separación por densidad en un gradiente autoformado. El experimento de Meselson y Stahl, que demostró la replicación semiconservativa del ADN, hizo uso de esta técnica.

4.4.4. Centrifugación en gradientes: zonal e isopícnica Tabla comparativa de las centrifugaciones zonal e isopícnica:

Colocación de la muestra

Centrifugación zonal Parte superior de un gradiente de densidad preformado

Separación en Coeficiente de sedimentación función de *Isocrática se refiere a que el gradiente es continuo

Centrifugación isopícnica La muestra se disuelve en una solución isocrática*. A veces en la parte superior del gradiente Densidad de la partícula

Solutos para formar gradientes de densidad • • • • •

El soluto utilizado ha de ser de bajo peso molecular. Se debe elegir el intervalo de densidad adecuado a la separación. Evitar interferencias con las partículas a separar (naturaleza osmótica, métodos de detección). El soluto usado tiene que ser fácil de eliminar, barato, no tóxico ni corrosivo, esterilizable. También hay que tener en cuenta otros factores como: pH, fuerza iónica, viscosidad, características osmóticas, pendiente do gradiente (lineal, cóncavo, convexo…).

Los principales solutos usados para centrifugación zonal son: •

•

Sacarosa: Disacárido empleado en la separación y purificación de materiales biológicos mediante centrifugación zonal. Presenta una alta viscosidad, lo que no le permite alcanzar grandes densidades. Osmóticamente activa (no útil para aislamiento de células, puesto que las células que acaben en las zonas más concentradas del gradiente se secarían por osmosis). Barata. Se utiliza en el estudio de proteínas por su carácter no iónico. Ficoll: Polisacárido sintético de alto peso molecular (400 kDa). Con alto contenido en grupos hidroxilo (buena solubilidad en medios acuosos). Puede ser esterilizable. Su viscosidad es menor que la de la sacarosa y no altera la presión osmótica del medio. No iónico. Estable a pH neutro y alcalino.

Los principales solutos usados para centrifugación isopícnica son: •

•

Percoll: Ácido silícico revestido de un derivado de polivinilo que presenta baja viscosidad a densidades altas, no afecta a la presión osmótica del medio y es estable a pH entre 5 y 10. Es soluble en soluciones acuosas. Puede utilizarse para centrifugaciones zonales, preformando gradientes, o bien para centrifugación isopícnica, ya que la centrifugación de percoll en rotores angulares durante 20-30 minutos y 20.000-100.000 g produce un ligero gradiente, independientemente de la densidad inicial. Se suele usar para complejos proteicos. Cloruro de cesio: Sal que rinde altas densidades manteniendo la viscosidad del medio adecuada. Es un soluto de baja masa molecular; sin embargo, uno de sus principales problemas es que presenta un gran poder osmótico, por lo que nunca se emplea para la separación de componentes celulares. Iónico, no se usa para el aislamiento de proteínas. Se emplea muchísimo en la separación de ácidos nucleicos mediante centrifugación isopícnica. Fácil de eliminar. Caro. Muy corrosivo, por lo que en su manejo se emplean rotores de titanio.

La sacarosa, el ficoll y el cloruro de cesio son los más usados en general.

4.4.5. Centrifugación analítica La centrifugación analítica se utiliza para estimar las propiedades físicas de una partícula: • • •

Se aplica a sustancias lo más puras posible. Se realiza a altas velocidades, normalmente en ultracentrífugas (100.000 rpm). Se necesitan sistemas ópticos para detectar la posición de la partícula en cada momento (detectores): o Ultravioleta. o Índice de refracción. o Interferencia.

Este tipo de centrifugación tiene varias aplicaciones: • • • •

Averiguar si el aislado es puro. Averiguar la proporción relativa de dos componentes. Interpretar posibles estructuras. Calcular coeficiente de sedimentación.

Los tipos de detectores que se utilizan en este tipo de centrifugación son: • •

•

Ultravioleta: indicado para absorción específica a esa longitud de onda (por ejemplo, ADN). Presenta el problema de que polímeros como el polietileno y el PEG absorben en la zona UV. Schlieren: mide variaciones del índice de refracción frente a la distancia. La muestra suele tener mayor índice de refracción que el solvente puro. La desviación radial en la dirección de la luz se relaciona con la concentración. Interferencia: Se basa en la difracción diferencial de luz por el solvente y la muestra. La luz que atraviesa la muestra y la del solvente interfieren produciendo sectores de luz y oscuridad, que se verán desviados verticalmente de forma proporcional a la concentración.

Análisis de sistemas en asociación

El análisis de sedimentación puede proporcionar información útil relacionada con los cambios de peso molecular cuando las moléculas se asocian para formar estructuras más complejas. Los experimentos de equilibrio de sedimentación proporcionan: • • • • •

El peso molecular del monómero. El peso molecular del complejo. La estequiometría para interacciones heterogéneas. La fuerza de la interacción entre componentes. La termodinámica de la reacción.

En resumen:...