Tema 4 - Apuntes tema 4 PDF

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Apuntes tema 4...

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Tema 4: Genomas víricos. 1. Esquema de Baltimore Es muy sencillo y en un esquema tenemos representados los diversos tipos de genomas y la estrategia que siguen para obtener el RNA mensajero. Baltimore era el que descubrió la actividad de transcriptasa reversa. Podemos ver que son 7 grupos: doble cadena de DNA, sencilla de DNA, doble de RNA, positiva sencilla de RNA, cadena negativa sencilla de RNA, RNA cadena sencilla positiva con actividad transcriptasa inversa, genoma de DNA de doble cadena con huecos con actividad transcriptasa inversa. Podemos ver la estrategia que usa cada uno para producir el RNA mensajero. El RNA mensajero lo consideramos siempre cadena positiva. Pero no todo el RNA que es positivo va a ser mensajero. La cadena equivalente al mRNA, es decir, la complementaria de DNA, se va a considerar negativa (por convenio). El mRNa está listo para ser cogido por los ribosomas y traducido a proteínas.

2. Estrategias de cada grupo para el mRNA mensajero • En los de dsDNA, la cadena negativa sirve de molde para el mRNA. • Los de ssDNA, producen dsDNA i la negativa sirve de molde para el mRNA. • Los genomas de dsRNA, la negativa sirve de molde para producir el mRNA. • El genoma de RNA cadena negativa sirve de molde directamente para el mRNa. • Los de RNA de cadena positiva sencilla, la mayor parte se comporta directamente como mRNA. Pero hay algunos virus que para producir el mRNA hacen un intermediario de cadena negativa (Coronavirus).

• Los RNAs de cadena positiva con actividad transcriptasa: la cadena de RNA positiva sirve de molde para el DNA de cadena negativa i éste sirve para dar lugar el mRNA.

• Los de DNA con huecos, acaban de completar la doble cadena de DNA, i la negativa sirve de molde para el mRNA.

3. Los genomas víricos de DNA o RNA son estructuralmente diversos Podemos encontrar algunos lineales, circulares, segmentados, con huecos, de cadena simple o doble de DNA o RNA, ambisense (un trozo hacia un sentido y otro hacia el contrario), unidos a proteínas, con cross-links… Tanta variabilidad no se sabe de donde aparece, se supone que por las condiciones diferenciales que ha habido durante la evolución, y que en el inicio había solo RNA y esto puede ser una posible explicación. Otro caso es que los genomas RNA en su proceso de replicación no tienen corrección y por tanto se pueden dar muchas mutaciones que pueden ayudar a los virus a ir modificando su evolución y supervivencia. Hay mucha variabilidad en el tamaño, los de dsDNA son muy grandes. En el caso de los virus satélite, necesitan co-infectar con otro virus para que le aporte proteínas que no tiene por si mismo. Este caso son los que tienen genomas más pequeños. Los virus disponen de “trucos” para poder realizar todas sus funciones con un genoma muy pequeño. El virus del sida tiene un genoma de 10000 pares de bases, pero tienen tres marcos de lectura. Podemos ver en la imagen que las barritas bajas son metioninas, las altas son stop, i los blancos son codificantes. Por tanto, se observa que tiene codificación de genes en los tres marcos de lectura. Es una manera de aprovechar el genoma al máximo. Otro truco es que muchas veces, si son de doble cadena, las dos cadenas codifican de proteínas. Hay que tener en cuenta que los genes los podemos repartir en tres grupos: immediate early, early, late. Así que no se expresan todos a la vez.

Los virus bacteriófagos tienen unos genomas enormes con cientos de genes. El fago T4 es el de la imagen. Podríamos pensar que al infectar bacterias será un virus muy sencillo, pero no. Podemos ver que los genes tienden a estar agrupados según lo que codifican. Otro ejemplo de virus patógeno humano es el de la hepatitis C que es muy sencillo, es de RNA de cadena sencilla y codifica por 7 genes. Todo el genoma se transcribe, está muy aprovechado. Con estos dos ejemplos podemos ver que no tiene ninguna relación con la complejidad del organismo que infectan ya que los bacteriófagos son muy complejos y en cambio el de la hepatitis C es sencillo. Otro virus ejemplo es el de la hepatitis B (es del séptimo grupo) que tiene DNA de doble cadena con huecos y actividad retrotranscriptasa. Sólo produce 4 proteínas que se solapan y que están en marcos de lectura distintos.

Qué tipo de proteínas codifica el genoma del virus? Va a codificar proteínas que sirvan para la replicación del genoma, proteínas de la cápside, de la envuelta (estructurales) i proteínas que bloqueen el ciclo replicativo. También proteínas que modifiquen la actividad del huésped. Además, pueden producir proteínas que les permitan entrar a otras células. Pero hay otras proteínas que no producen: Toda la maquinaria completa de la síntesis proteica. Se ha visto que nuevos virus (Mimivirus) que es muy grande (como una bacteria casi) y es capaz de codificar muchas proteínas implicadas en la síntesis proteica. No codifican proteínas de membrana, proteínas involucradas en la obtención de energía, y tampoco proteínas que formen parte de telómeros y centrómeros. Es muy probable que aún no los hayamos encontrado pero que de algún modo sí que existen.

dsDNA genomas Las clases más importantes que infectan a mamíferos son Adenovirus, Hepadnaviridae, Herpesvirus, Papilomaviridae, Polyomaviridae, Poxvirus (viruela por ejemplo). La estrategia que siguen estos virus es: la cadena negativa sirve de molde para el mRNA que se va a traducir a proteínas. La doble cadena, cada una generara su complementaria para dar lugar a la replicación del DNA. Dentro de los genomas de DNA de doble cadena, tenemos algunos sencillos y pequeños que usan directamente la DNA polimerasa de la célula huésped (Polyomavirus, Papilomavirus). En cambio los Poxvirus, Adenovirs i Herpesvirus codifican su propia DNA polimerasa.

Hay que considerar que todos los virus de DNA entran en el núcleo de la célula huésped usen o no la maquinaria de replicación. Hay una excepción que son los Poxvirus que se quedan en el citoplasma.

Esquema de la infección de un virus herpes: En el caso de los virus herpes, les han dado una nomenclatura especial a los genes: immediate early son los alfa, los early son los beta, y los late son los gamma. Una vez entra el virus de transcriben los genes immediate early. Entre estos genes hay un factor de transcripción que bloquea su expresión y estimula la transcripción de los early y ligeramente a los late. En este segundo grupo de early vuelve a haber factores de transcripción que bloquean su expresión y estimula la expresión de los late genes. Con lo cual en el tiempo lo que vemos son como unas oleadas de transcripción. Esta es una manera de poder hacer una expresión ordenada en el tiempo.

ssDNA genomas La estrategia que tienen es que el DNA de cadena sencilla produce la complementaria y entonces es lo mismo de antes.

La cadena negativa sirve de molde para los mRNA. I al tener el DNA en forma de dsDNA, se separa y ya dan lugar a los virus de ssDNA. Un ejemplo de estos virus es el Circoviridae (se le llama virus TT) del cual está infectado mucha parte de la población pero no se sabe qué hace. Y por otro lado hay un virus que se llama Parvoviridae.

RNA$genoma$$ La célula huésped no tiene una RNA polimerasa dependiente de RNA, por tanto la tienen que codificar ellos mismos, los virus. Con esta polimerasa generan las copias del genoma RNA y también las cadenas de mRNA a partir del molde de RNA original. En los RNA de doble cadena un ejemplo es Reoviridae, que usa su cadena negativa para dar lugar el mRNA mensajero cadena positiva. Pero ademas, la cadena positiva del dsRNA va a servir como intermediario replicativo para dar lugar a mas copias del genoma.

ssRNA:$(+)$polaridad$$ Son patógenos de mamíferos, como ejemplos encontramos los Picornaviridae (virus de resfriado común y virus de la polio), Calciviridae, Astroviridae que dan gastroenteritis, Coronaviridae (SARS), Arteriviridae, Flaviviridae (hepatitis C), Retrovirus (virus de la sida), Togaviridae (virus de la rubeola). La estructura de su genoma es prácticamente como un mRNA. Muchos tienen poliA, sitios no codificantes. La mayor parte de estos virus, lo que hacen primero es traducirse (no transcribirse) y da lugar a proteínas directamente, es decir, actuan como mRNA ellos mismos. Y luego se genera un intermediario replicativo de cadena negativa que va a servir de molde para producir más copias del genoma cadena positiva que se seguirán comportando como RNA mensajero. Vamos a ver 2 ejemplos de 2 formas de hacerlo: Picornavirus, Coronavirus

En el caso de los Picornavirus todo su genoma es considerado como un mRNA enorme que se traduce de golpe y se obtiene una poliproteína enorme que va sufriendo cortes en sitios concretos. Se producen cortes en cascada, primero dos cortes que dan lugar a tres bloques i a partir de ellos se van escindiendo. La escisión es en cascada i organizada. Hay sitios de escisiones alternativas. Los cortes pueden ser en cis o en trans. En cis quiere decir que la propia secuencia estimula el corte. Los Coronavirus tienen alguna peculiaridad. Se sigue cumpliendo que lo primero que hacen es traducirse, pero en lugar de traducirse todo el genoma, solo lo hace un trocito, que es lo que va a producir la RNA polimerasa dependiente de RNA. Entonces esta polimerasa transcribe y genera la cadena negativa. A partir de esta cadena negativa sirve por un lado de intermediario replicativo para generar copias replicativas del genoma, y por otra parte sirve de molde para los mRNA. En general se suele dejar para el final la generación de proteínas estructurales. Gene expression of RNA.

El genoma está representado con una flecha, cuando va a la derecha es un genoma de RNA polaridad positiva, i cuando va a la izquierda es un genoma de RNA de polaridad negativa. Muchas flechitas indican que el genoma está segmentado. También podemos ver los ambisense. El ultimo dibujo es un retrovirus (dos flechas porque son diploides). Podemos ver que no hay cadena positiva segmentada. El quinto grupo es doble cadena de RNA. En la segunda columna te dice si tiene la transcriptasa en virión, si llevan o no llevan la proteína físicamente en el virión (RNA polimerasa dependiente de RNA). Podemos ver que solo los de cadena positiva que no tengan actividad transcriptas inversa, no llevan la RNA polimerasa dependiente de RNA (no la llevan físicamente pero si en el genoma codificada). Esto es debido a que cuando entra el virus en la célula huésped lo primero que hace es traducirse de forma que ya consigue su proteína. No le hace falta llevarla físicamente en la partícula vírica. De forma que si infectamos solo con el genoma (transfectamos), sí que se consigue infectar (porque se traduce y obtiene sus proteínas necesarias). Esto último es lo que vemos en la tercera columna. La cuarta columna de la tabla no indica como son los mRNA en cada caso. La 5 columna nos indica como es la primera transcripción y la última columna un ejemplo de virus de cada tipo. En el caso de los Coronavirus, podemos ver que produce varios productos de mRNA distintos. En el caso de los Picornavirus se genera una poliproteína muy grande como hemos explicado anteriormente.

ssRNA,$( ssRNA,$(--)$polaridad )$polaridad$$ Los virus que infectan mamíferos en este caso son: Paramixovirus, Rhabdoviridae (destacar el de la rabia que tiene forma de bala), Bornaviridae (peques), Filoviridae (forma filamentosa y hay muchos virus que producen fiebres hemorrágicas), Orthomyxoviridae (el virus de la gripe que es cadena simple y segmentada), Arenaviridae (como el virus de Lassa). Dentro de los virus de RNA de cadena negativa sencilla, tenemos que hay como dos tipos de genomas: los que tiene una única cadena y los del genoma segmentado. En una cadena tenemos los Paramixovirus y los Rhabdoviridae. Como ejemplo de virus segmetados tenemos los Orthomyxoviridae (entre 6 i 8 fragmentos). El virus de la gripe (influenza) tiene 8 fragmentos. La estrategia que tiene este tipo es que el genoma se usa de molde para los mRNA, y también sirve para generar cadena positiva que a su vez servirán para hacer las copias negativas del RNA. La cadena de RNA (-) sirve de molde para los mRNA. La maquinaria replicativa, cuando termina un mRNA se suelta y sigue a traducir otro mRNA. Cuando se sintetiza la proteína N, esta se une a la maquinaria replicativa y no permite que se separe del molde de RNA de forma que se genera una copia completa de todo el molde generando así el molde replicativo (cadena +). El ciclo de infección de un virus de cadena negativa: en el ejemplo tenemos el virus de la rabia. Cuando infecta la célula, el RNA de cadena negativa sirve de molde para los mRNA y también para las cadenas complementarias que van a servir de intermediarios replicativos para generar nuevas copias de genomas que obviamente servirán para las nuevas partículas víricas, pero también para sintetizar más mRNA por ejemplo. Otro ejemplo de ciclo vírico tratamos la influenza: Los virus RNA. tienen su ciclo vírico en el citosol, a excepción del virus de la gripe que entra en núcleo. Una vez que infecta el genoma entre en núcleo, el genoma sirve de molde para mRNA mensajero que se traducen en Otro ejemplo de ciclo vírico tratamos la influenza: Los virus RNA. tienen su ciclo vírico en el citosol, a excepción del virus de la gripe que entra en núcleo. Una vez que infecta el genoma entre en núcleo, el genoma sirve de molde para mRNA mensajero que se traducen en citoplasma, y también servirá de molde para los intermediarios replicativos que a la vez servirán para nuevos genomas. El genoma de influenza sale del núcleo con las nucleoproteínas necesarias ya asociada. Cada fragmento da un mRNA i puede hacer splicing alternativo. Esta peculiaridad de tener el genoma segmentado es lo que induce que en las infecciones se produzca una reorganización del genoma. Esto pasa cuando una célula se infecta por más de un virus de la gripe. Entonces se puede generar partículas víricas nuevas con mezcla de segmentos del genoma generando así nuevos virus de la gripe (antigenic shift).

En la clasificación de Baltimore no teníamos incluidos en ningún grupo los virus de ambisense, porque en general se les incluye en los RNA cadena sencilla polaridad negativa. Como ejemplo de antisense tenemos los Arenavirus y Bunyaviridae.

El Arenavirus, cuando infecta la célula huésped, la parte con polaridad negativa sirve de molde para generar un mRNA que se traducirá para producir una proteína (la proteína N) que se va a encargar (es un enzima) de que se produzca la replicación (que se genere el intermediario replicativo). Una vez tenemos el intermediario complementario de replicación con lo cual lo que antes era positivo ahora es negativo, y al revés. Entonces en este intermediario replicativo se traduce la parte negativa (que antes era la positiva) que va a dar lugar una proteínas estructurales. La proteína N primera se encarga de conseguir que el nuevo intermediario replicativo acabe de dar copias del genoma.

ssRNA$(+)$polaridad$con$intermediario$de$DNA$$ Estos tienen transcriptasa inversa. Una familia vírica única: Retroviridae. Está compuesta por varios virus patogenos de humanos: Human immunodeficiency virus (HIV), Human T-lymphotropic virus (HTLV). Estos virus tienen un mecanismo muy especial. Su estrategia es que a través de la transcriptasa inversa, su RNA cadena positiva sirve de molde para generar un DNA cadena negativa y que a su vez servirá de molde para generar una doble cadena de DNA. En este estado se le llama provirus. A partir de la cadena negativa del DNA, sirve de molde para los mRNA y para los nuevos genomas de RNA cadena positiva. En su ciclo infectivo: el genoma sirve de molde poco después de entrar en el citoplasma. Se produce la retrotranscripción. El DNA de doble cadena se circulariza y entra al núcleo. Solo cuando es circular, es capaz de integrarse en el genoma de la célula huésped y se comporta como un gen más de la célula huésped. Usa la RNA polimerasa de la célula huésped para producir sus mRNA. Usa los tres marcos de transcripción, que da poliproteínas que luego se escinden. Estos mRNA también pueden sufrir splicing alternativo. Con lo cual puede dar a gran variabilidad de mRNAs.

Una cosa que se ha visto en los retrovirus es que son especialmente resistentes a las radiaciones ultravioleta. Se piensa que es debido a que tiene dos copias del genoma y que se produce una recombinación del RNA en muchos casos, obteniendo variabilidad. Se repara el RNA a través de la cadena que no está dañada.

$ Gapped$dsDNA$genomes$$ En este caso solo tenemos Hepanavirus, el causante de la hepatitis B. Estos virus una vez infectan reparan los huecos que tiene y ya se comporta igual como un DNA de doble cadena. Lo que cambia es la generación de más copias de su genoma. Lo que hace es un intermediario de RNA de cadena positiva para generar sus copias de DNA. Se genera el genoma con huecos. El dsDNA es circular abierto, relajado. En un extremo tiene unido RNA, en el otro tiene unido una proteína, aumentando su estabilización

En el ciclo infectivo lo que ocurre es que el virus de la hepatitis B, cuando infecta entra en el núcleo y usa la DNA polimerasa de la célula huésped para reparar su DNA que estaba abierto. Entonces obtenemos un genoma supercoil. El genoma no se fusiona en el genoma de la célula huésped, se mantiene en el núcleo de manera episomal. Este DNA genera una cadena de RNA positiva (pregenoma) que sale fuera al citoplasma y empieza a generar partículas víricas junto con la transcriptasa inversa. Entonces en el proceso de maduración de los viriones, es la transcriptasa inversa la que se encarga de pasar a DNA y volver a generar la doble cadena de DNA circular covalentemente con huecos.

Caso del virus de la polio (picornavirus): infectious clone Si infectamos únicamente con el genoma, vamos a obtener partículas víricas igualmente. Esto es una gran ventaja y se ha usado en los últimos años para estudiar los virus a través de unas técnicas que se llaman de genética inversa. Esto es debido a que son clones infecciosos: clon de cDNA que son capaces de transfectar. Esta estrategia de la genética inversa nos puede servir para determinar la función de una proteína viral o un dominio. Entonces se hace el cDNA de esa proteína y se muta y permite saber las funciones. En cambio, los virus RNA restantes, lo primero que tienen que hacer es llevar una proteína en el virión (fisicamente, aparte de codificada), porque lo primero que tienen que hacer es transcribirse con una RNA polimerasa que no se la puede proporcionar la célula huésped. De forma que el genoma solo no puede infectar sin la RNA de su cápside. La única manera de infectar con el genoma de estos virus es hacer una coinfección con un plásmido que contenga la RNA polimerasa necesaria o un helper virus....