TEMA 7 CitogenÉtica - Apuntes 7. PDF

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Joan Blanco Rodríguez...

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TEMA 7: TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN CROMOSÓMICA. 1). TINCIÓN UNIFORME. El colorante se tiñe toda la longitud del cromosoma (pero no de forma diferencial). La información que proporciona es sobre morfología, posición del centrómero (metacéntrico, submetacéntrico, acrocéntrico y telocéntrico) así como existencia de constricciones secundarias. También se pueden identificar reordenaciones cromosómicas. NO permite cariotipar: caracterizar cada cromosoma. Utilidades: análisis de roturas y anomalías cromosómicas inducidas por agentes genotóxicos (ex. radiación ionizable). Ex. si la luz UVA a producido fragmentación. Ejemplos de colorantes:   

Giemsa. Tiene carga positiva, por lo que interacciona con la carga – del g.fosfato. Orceina en solución de ácido: orceína acética. Naranja de acridina, si es dsDNA (se tiñe naranja) o ssDNA (verde).

2). TÉCNICAS DE BANDEO CROMOSÓMICO. Conjunto de bandas transversales que aparecen en el cromosoma, después de haberlo sometido a un tratamiento. Estas bandas tienen una medida e intensidad diferencial, por ello hablamos de bandas positivas (más intensidad de colorante) y bandas negativas (menos intensidad). Este patrón de bandas se mantiene en el tipo celular y en las diferentes fases del desarrollo. Nomenclatura de las bandas cromosómicas Centrómero delimita los brazos: corto p (petite) y largo q (siguiente letra del abecedario)Niveles de diferenciación:  Regiones, en número ascendente hacia la región telomérica. De forma que la región uno siempre será la colindante al centrómero.  Región se subdivide en bandas, se numeran en forma ascendente en la medida que nos acercamos al telómero.

¿Por qué aparecen las bandas? No aparecen de forma aleatoria, dependen de la organización de la cromatina (resolución y procedimiento). El número de bandas es variable en función de la longitud de los cromosomas, es decir, si estos cromosomas están más descondensados (laxos) o condensados. Si el cromosoma está descondensado el nivel de resolución es mayor, y por tanto vemos un mayor numero de bandas. Pero también aumenta la complejidad para cariotipar. La condensación depende del procedimiento y el timing, hay que ser precisos en el laboratorio y limitar al máximo la influencia de factores externos. Orden cronológico en el que estas técnicas aparecen. Hasta hace 50 años no se podía distinguir entre cromosomas: bandas Q, bandas G/R, bandas C, bandas T, bandas NOR y bandas de replicación. 2.1).BANDAS Q (QUINACRINA). El colorante era quinacrina que fue sustituido fluorocromo DAPI: microscopio de fluorescencia (su resolución es menor que la de un microscopio convencional). Las bandas aparecen porque los fluorocromos tienen más afinidad por regiones ricas en A + T. Por tanto hay un incremento de la señal fluorescente: bandas positivas. Otros autores dicen que la unión esta condicionada por el componente proteico de la cromatina. Aplicación actual: no se utilizan ni en diagnostico clínico ni en investigación básica. Pero se aplicaron en la determinación del origen parental (daban muchos falsos positivos), debido a que este bandeo permite observar polimorfismos (variación) cromosómicos en humanos:  Región heterocromática del Y así como de otros cromosomas 1,9,16.  Centrómeros y satélite

2.2). BANDAS G (GIEMSA)/ R (REVERSE). Bandas G son las más utilizadas hoy en día, a excepción de los franceses que aplican una variante (bandas R) donde una banda G positiva es una banda R negativa, R de reverse, resultados al revés. Tinción de una extensión cromosómica con giemsa, tripsina (proteasa) o con desnaturalizantes moderados (temperaturas elevadas y solución de sales, que hace variar el pH y da lugar a una cierta desnaturalización proteínas del cromatina). ¿Por qué aparecen? No está claro del todo.

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Dutrillaux et al. (1972).

Cuando se desnaturaliza el componente proteico de la cromatina (ex. histonas), regiones de DNA queda expuesto con carga negativa del g.P, esto permite la interacción con el colorante (banda positiva). Donde las histonas no han desnaturalizado, no se colorean y son bandas negativas.

 Restructuración de la cromatina: reorganización de los cromómeros. Eran partículas discretas de cromatina con un grado de condensación mayor. Esta teoría se volvió a refinar gracias a Saitoh y Laemmil en 1994. Dicen que la fibra de cromatina se organiza formando loops con diferentes grados de compactación sobre el scaffold proteico (matriz) gracias a secuencias sar. Bandas Q positivas, son ricas en loops habrá muchas secuencias SAR, estas son ricas en A + T. Se suele asociar a una condensación mayor. Banda Q= bandas G. En bandas claras hay pocos loops, otra forma de decirlo es que hay pocas secuencias SAR y con ello [A+T relativa] es baja. Bandas R (reverse) el patrón de bandas inverso al de las bandas G. Una banda G positiva es una banda R negativa. De la misma forma que una G - es una R+ . además las desnaturalizaciones son extremas. No se sabe por qué aparecen.

2.3).BANDAS C ( HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA). Desnaturalización extrema de la extensión cromosómica, gracias a cambios de pH: solución muy ácida y después otra muy básica.  Tinción con giemsa.  Técnica sensibles a la humedad y temperatura. En la actualidad no se aplica. Aunque sirve para ver fusiones cromosómicas, o dicéntricos (son inestables se pierden). Marcan nada más la heterocromatina constitutiva. Regiones transcripcionalmente inactivas. Ex. centrómeros y regiones heterocromáticas del 1, 9, 16 y el Y. Las bandas aparecen porque el tratamiento degrada la cromatina, esto ocurre más rápido con la eucromatina (como su grado de compactación es menor está más expuesta), sin embargo en regiones heterocromatina está “más protegido”. 

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Bandas T (telómeros). Es una variante de las bandas R. Es una desnaturalización todavía más extrema. Y solo aparecen bandas positivas en telómeros, son regiones ricas en C+G . por tanto son tambien G-

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Bandas NOR. (nucleolar organization región). Es una variante de las bandas C, tiñe restos de ribonucleoproteínas localizadas en las regiones organizadoras del nucléolo. Si se utiliza como colorante nitrato de plata las bandas se llaman Ag-NOR.

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Bandas de replicación. Se utilizan para distinguir la replicación en la fase S y las regiones que replican al final de la fase S. Por tanto sirve para determinar el tiempo de duplicación de las bandas. Se utiliza una análogo de la timina, ex. 5- BrdU (bromodesoxiuridina) después los cromosomas se tiñen con giemsa. Entonces las regiones que han incorporado 5BrdU se tiñen de forma diferencial.  Fases iniciales: bandas G Fases tardías. Giemsa positiva. G+

2.4). NOMENCLATURA DEL BANDEO CROMOSÓMICO.   

Primera letra. Indica el tipo de banda: Q,G, C,R. Segunda letra. El tipo de tratamiento. F: fluorescente. T: tripsina, B: 5- BrdU. Tercera letra. Colorante. Ex. quinacrina, giemsa.

Las técnicas de bandeo solo son aplicables en cromosomas de mamíferos y en pájaros (solo en los macrocromosomas, en microcromosomas no son aplicables). Las bandas no varían en función del tipo celular, desarrollo embrionario. Por tanto se mantienen dentro de la especie. Lo que hacen es evidenciar una organización muy concreta de los cromosomas (metafásicos- mitóticos). Evidencias de la relación entre bandas cromosómicas y eucromatina o heterocromatina (concepto citológico en función de la tinción). La eucromatina: uniforme, heterocromatina: se tiñe de forma diferencial. Esta eucromatina citológica se evidencia con bandas Q, G y R. Caracterización:     

Composición de bases. A+T frente C+G. Contenido génico. 20% bandas G+ frente al 80% bandas GPresencia de secuencias de DNA repetitivas. LINES Y SINES. Procesos de replicación del DNA. Estructura de la cromatina.

Si analizas las características eucromaticas, indican que las bandas aparecen por que hay una organización de la cromatina diferencial Un cromosoma metafasico mitótico es una molecula de DNA condensada de una manera concreta con una finalidad concreta. Pero esto es algo muy desconocido. 3). TÉCNICAS BASADAS EN LA HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE FISH. Empezaron en la década de los 90. Se utilizan para visualizar secuencias especificas en cualquiera de las fases del ciclo celular. Esta basada en la capacidad del DNA para des y renaturalizar. Hay dos secuencias de DNA: diana y sonda:  Diana: es lo que se pretende identificar y por tanto hay que desnaturalizarlo para tenerla en forma de monocadena (gracias a temperaturas elevadas).  Sonda (probe) fragmentos de secuencias complementarias a la secuencia diana, marcados con fluorocromos (también se ha de desnaturalizar, monocadena).  Un fluorocromo es una molécula que se excita con luz ultravioleta y emite una radiación. Para que se produzca la hibridación, han de renaturalizar. Para asegurar la efectividad del experimento se añade exceso de sonda, para que a la hora de renaturalizar sea muhcho más probable que el DNA diana se hibride con la sonda y no con su complementario original. Se necesita un microscopio de fluorescencia. Así se detecta la presencia de esta secuencia en cualquiera de las fases del ciclo celular.

TIPOS DE SONDAS     

Especificas para un locus concreto. Específicas de regiones centromérico. Específicas de regiones telomérica. Complementarias a todo un cromosoma: painting probe. Sondas que para todo el genoma. Así se tienen todo el material genético marcado con fluorescencia.

Como hay muchas sondas y un gran mercado biotecnológico por detrás, en verdad hay técnicas derivadas del fish. 3.1). Hibridación multicolor. Como se pueden estudiar en cualquier fase del ciclo no se requiere cultivo celulares ni células en división. Los resultados son mucho más fáciles de interpretar que las técnicas de bandeo. La única limitación es la especificidad, si no pones la sonda complementaria a la diana, no estas haciendo nada. Limitación de fluorocromos (no hay tantos colores). Solapación de señales de hibridación.

3.2). Técnicas de m-fish o sky-fish. No hay limitación del nº de cromosomas a visualizar. Se identifican todos los cromosoma mediante un pintado completo, pero no hay 23 fluorocromos diferentes, pero cada cromosoma se identifica con un combinación de fluorocromos. Al final es una tinción uniforme, pero una tonalidad para cada cromosoma, se necesita un software para saber la composición de cada uno de los colores.

Se

analiza todo el complemento cromosómico en un solo experimento, se necesita que sea en metafase (da igual la calidad de esta metafase) y permiten detectar reorganizaciones cromosómicas en equilibrio. Ex. en la imagen el cromosoma 3. (Ex. translocación). Es una técnica que tiene poca resolución, por tanto no se puede ver pequeñas duplicaciones o deleciones y el protocolo requiere personal muy experimentado.

3.3). HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARADA (CGH).

El punto de partida es DNA genómico obtenido a partir de extracción cromosómica.  Células control (cromosómicamente normales) que se marcan con un fluorocromo. Ex. rodamina (rojo)  Células problema que se marcan con un fluorocormo de espectro verde. Ambos DNA se mezclan en la misma cantidad, se desnaturalizarlos para tener monocadenas. Paralelamente hay extensiones cromosómicas con metafases control (cromosomas desnaturalizados sobre los que se hibridaran las muestras anteriores). El DNA control y problema se une al de la extensión, se trata de ponerlos en exceso para que cuando los cromosomas renaturalicen lo hagan con las secuencias marcadas.   

Región de color amarillo (DNA control y DNA problema hibridan en cantidades parecidas). Si es rojo: delección, porque en la muestra problema no lo hay entonces no compite con el de la control . El rojo por tanto se unirá siempre. Verde: duplicación. amplificación en el DNA problema.

Esto implica desarrollo de un software de análisis automático. Un programa que permita posicionar todos los cromosomas y que analice el perfil de radiación. Ventajas y limitaciones:   

Análisis de todo el complemento cromosómico en un experimento. No requiere metafases de buena calidad. Pero solo se puede aplicar en metafase. Pocas células y poca cantidad de DNA.

Inconvenientes pues no permite detectar reorganizaciones cromosómicas en equilibrio. (no hay ni perdida ni ganancia de material, porque la cantidad de material es la misma.Poca resolución para pequeñas duplicaciones o delecciones. Manos expertas. La baja resolución y la imposibilidad de analizar células que no estén en metafase. Se superan grancias a técnicas de array- CGH. Utiliza los mismos principios, pero el soporte es diferente. Pues solo hay secuencias de medida BACs (medida determinada) que habrá que amplificar por PCR. Es todo más a nivel génico, para saber el programa de expresión génica de una célula concreta. Se utilizan mucho en oncología y en diagnostico prenatal y posnatal. 4). EL COMPLEJO SINAPTONÉMICO.

Reorganizaciones cromosómicas. Para estudiarlo el procedimiento:  Tratamiento con hipotónico (siempre para hinchar las células).  Tratamiento con formaldehido para eliminar la cromatina.  Tinción del complejo. Como es de naturaleza proteíca se hace con nitrato de plata. Cromosomas del espermatozoide. Hasta que no se desarrollo la fish y no se podía descondensar la cromatina del espermatozoide, no se podían estudiar estos cromosomas si no se seguía un protoco muy chungo. Haber el espermatozoide esta en interfase y su material solo se volverá a condensar Se cogían espermatozoides y oocitos de hampster (zona pelucida que garantiza que la fecundación sea especie- especifica). Se fecundaban los oocitos de hampster con espermatozoides humanos, y entraban más de un espermatozoide. Se formaba un embrión hibrido: humano – hámster y se extraían los cromosmoas y se podían cariotipar....