TINCIÓN Y MICROSCOPÍA PRÁCTICA 2 PDF

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Práctica de microscopia y tinciones ...

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Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato

REPORTE PRÁCTICA 2: TÉCNICAS PREPARATORIAS EMPLEADAS EN MICROSCOPIA ÓPTICA E ILUMINACIÓN DE KÖHLER. MICROBIOLOGÍA FARMACÉUTICA EQUIPO 3 4FV1 AGUILAR LIRA FRIDA SOFÍA FERNÁNDEZ RANGEL UZZIEL GARCÍA GARCÍA INGRID CASSANDRA HERNÁNDEZ PÉREZ LIZETH MAHOLI QUINTERO FRAUSTO CYNTHIA JANETH VELAZQUEZ GONZALEZ BRENDA GUADALUPE

Fecha de realización: 07 de Febero de 2019 Fecha de entrega: 14 de Febrero de 2019

ÍNDICE 1.- Objetivo ........................................................................................................................................................................... 1 2.- Introducción................................................................................................................................................................... 1 3.- Resultados y observaciones ..................................................................................................................................... 6 4.- Discusión de resultados............................................................................................................................................. 8 5.- Conclusión ..................................................................................................................................................................... 9 6.- Cuestionario .................................................................................................................................................................. 9 7.- Referencias .................................................................................................................................................................. 13

1.- Objetivo • Preparar frotis microbianos para su observación. • Identificar el mecanismo de acción de los colorantes sobre las células bacterianas. • Utilizar la técnica de iluminación de Köhler para la observación de las células bacterianas. • Identificar la morfología de las células bacterianas cultivadas. 2.- Introducción En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante información para la identificación temprana y definitiva de los microorganismos, con el cual para una tinción en microscopio es necesario (no en todos los casos) el uso de un colorante, que se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales. (López Esaú, 2014). 2.1.- Microscopio óptico compuesto Estos microscopios tienen dos o más lentes y utilizan luz visible para iluminar las muestras. Con los microscopios ópticos se pueden observar detalles finos de muestras muy pequeñas, esta imagen es captada por un conjunto de lentes en forma de imagen focal definida. Los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz pasan por un condensador el cual dirige los rayos de luz a la muestra para posteriormente llegar a los objetivos y al ocular donde la imagen será ampliada para su observación. (Tortora, Funke & Case, 2007)

Figura 1.- Microscopio óptico

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Partes de un microscopio. •

Fuentes de luz

Generalmente los microscopios ópticos usan bombillas de alta presión para así conseguir una alta intensidad y son altamente sensibles. •

Objetivos

La mayoría de los modelos actuales tienen 4 objetivos diferentes, 4X 10X 40X y el 100X que tiene que ser inmerso en aceite. •

Enfoque

El ajuste macrométrico controla el acercamiento de la lámina al lente, para ajustes finos se utiliza el ajuste micrométrico. 2.2.- Tinciones Simples. Se utiliza un solo colorante (básicos). • • •

Azul de metileno Safranina Cristal violeta

Compuestas. Se utilizan dos o más colorantes. Pueden usar mordentes y decolorantes • • •

Giemsa Wrigth May Grünwald (Eosina-Azul de metileno).

Tinción negativa. •

De Cápsula

Selectivas. Son utilizadas para dar color y aislar partes específicas de los microorganismos. • • •

Endosporas Flagelo Núcleo

Diferenciales. Reaccionan de manera diferente entre las distintas clases de bacterias. • •

Ziehl-Neelsen Gram 2

Como ejemplos. Tinción de Wright Es una técnica que se emplea generalmente para la diferenciación de elementos celulares de la sangre y es clasificada como una tinción policromática, dado que puede teñir compuestos ácidos o básicos presentes en una célula. Esta tinción tiene diversos usos en microbiología; en la parasitología, se le emplea en la búsqueda de hematozoarios como Plasmodium spp. El reactivo de Wright está compuesto por eosina y azul de metileno. (Eduardo Santambrosio, 2009) Tinción de Ziehl-Neelsen. Es la técnica comúnmente usada en el diagnóstico rutinario de tuberculosis, permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no lo son. La sensibilidad de esta tinción para identificar bacilos ácido-alcohol resistentes es del 74% y la especificidad del 98%. (Eduardo Santambrosio, 2009) Tinción de Gram Esta tinción permite agrupar bacterias en Gram-negativas y Gram-positivas de acuerdo al grosor de la pared bacteriana, así como su estructura y fijación de tinte. Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: •

Gram positivas

Se caracterizan por presentar una capa gruesa de peptidoglicano y carecer de membrana externa, con la tinción estas bacterias retienen el cristal violeta, provocando una concentración en la intensidad del color. (García, 1995) •

Gram negativas

La pared celular de las bacterias Gram-negativas es más delgada comparada con la de las Grampositivas además de contar con una capa externa con alta concentración de lípidos. A demás a la hora de realizar la tinción el cristal violeta no se fija en la bacteria como en las Gram-positivas y toman un color rojizo. (García, 1995).

2.3.- Morfología bacteriana. Clasificación bacteriana por su morfología:

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Figura 2.- Clasificación bacteriana por su morfología.

• • • •

Cocos (esféricas u ovaladas) Bacilos (cilíndricas o bastones) Espirilos (espiral) Vibrios

Clasificación bacteriana por su agrupación: • • • • • • • •

Diplococos Tétradas Sarcinas Estafilococos Diplobacilos Estreptobacilos Empalizadas Letras chinas

Clasificación bacteriana por afinación tintorial: • •

Tinción de Gram o Grampositivos o Gramnegativos Tinción de Ziehl-Neelsen o Ácido-alcohol resistentes o No ácido-alcohol resistentes. (Cercenado Emilia, 2010)

Colorante safranina. Es comúnmente utilizado para teñir tejidos biológicos, y sirve como herramienta en la detección de estructuras en células eucariontes y procariontes.

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El colorante safranina O, es conocido como de contraste, ya que se usa para diferenciar una estructura celular previamente teñida con otro colorante, se puede utilizar en distintas técnicas histológicas.

2.4.- Morfología colonial. La morfología colonial es comparable a una estadística ya que se deriva de una célula individual, pero es la característica de la masa celular. Así pues, por ejemplo, la pigmentación es aparente en la colonia, pero no en la célula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cápsula muy grande. La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas concéntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa. (Cercenado Emilia, 2010). TÉRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGÍA DE COLONIAS EN LA SUPERFICIE DE UN MEDIO SÓLIDO

Figura 3.- Morfología de cultivo sólido.

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TÉRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGÍA DE COLONIAS EN UN CULTIVO EN CALDO. Al igual que en los medios sólidos, en los medios líquidos las características de la bacteria sembrada se reflejan en las características que presenta el caldo inoculado como son: • • •

Turbidez: Opacidad más o menos densa, signo de crecimiento. Película: Crecimiento casi continuo sobre el líquido Sedimento: Depósito de células en el fondo del tubo que se resuspende al agitar.

Figura 4.- Morfología de cultivo sólido y semisólido.

3.- Resultados y observaciones Tinción diferencial Las primeras tinciones realizadas fue la de Gram la cual nos ayudó a conocer la morfología celular bacteriana y diferenciar si la muestra era una Gram positiva (color morado) o una Gram negativa (color rosa). Tabla 1. Tinción de Gram En la tabla siguiente se pueden apreciar las observaciones al realizar la tinción de Gram con muestra de Escherichia coli. Prueba

Medio de cultivo

Origen de la toma de muestra

Imágenes

Observaciones En las imágenes se puede apreciar un poco mejor en el 6

1

Manitol salado agar

Arroz en descomposición

objetivo 40 X; en éste se puede observar que seguramente es un racimo de uva, estafilococos y estreptococos. Objetivo 40 X

Manitol salado agar

2

Se puede observar en la imagen la forma de un racimo de uva, pueden ser bacilos.

Carne de res cruda en descomposición (Escherichia coli) Objetivo 100X

Tinción simple El colorante utilizado en ésta tinción simple fue safranina, el cuál se le aplicó a la muestra de Escherichia coli. Tabla 2. Tinción con safranina En la siguiente tabla se muestran las observaciones realizadas en la prueba con el colorante safranina. Prueba

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Muestra

Agar sangre

Origen de la toma de muestra

Imágenes

Observaciones Se puede observar bacilos individuales y en cadena. Son Bacilos gram()

Arroz en descomposicón

Objetivo 100x

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4.- Discusión de resultados Tinción diferencial Gram

•

La pared celular de las bacterias Gram negativas está conformada por una delgada capa de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas son lo opuesto, poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; por lo que la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las características tintoriales. Las bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado, mientras que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo. De acuerdo con la literatura consultada, a través de la tinción de Gram pueden valorarse la afinidad tintorial, forma y agrupaciones de las bacterias, lo cual se contrasta en la tabla 3.

Tabla 3. Tinción Gram. Identificación de la forma, cepa y agrupación de bacterias observadas en microscopio. Prueba 1

Resultado de la tinción Gram positivo

Forma Esféricas

Cepa Cocos

2

Gram negativo

Cilíndricas/bastone s

Bacilos

Agrupación Estafilococos/ estreptococos Estreptobacilo/cocobacil os

Es posible que en la prueba número 2 sí exista presencia de e.coli ya que es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram.

Tinción simple •

Safranina

Generalmente, la safranina o rojo básico 2 se utiliza como un colorante de contraste, ya que se usa para diferenciar una estructura celular previamente teñida con otro colorante. En este caso, se utilizó la safranina para realizar una tinción simple que permitiera observar la morfología de las bacterias cultivadas para poder identificarlas (Tabla 4).

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Tabla 4. Tinción safranina. Identificación de la forma, cepa y agrupación de bacterias observadas en miscroscopio. Prueba 3

Tinción Safranina

Forma Esférica

Cepa Cocos

Agrupación Estafilococos

Los colorantes son sustancias tóxicas, por lo que el proceso de tinción generalmente resulta letal para los microorganismos, provocando su inmovilización, lo cual puede significar una ventaja o desventaja para el investigador según los objetivos de la tinción. Algunos colorantes solo tienen efecto letal para determinadas especies o géneros bacterianos, siendo utilizados como constituyentes de medios de cultivo selectivo para impedir el desarrollo de microorganismos indeseables y favorecer el desarrollo de las especies deseadas para el estudio. Por ejemplo: el verde de malaquita. Otros se emplean como desinfectantes microbianos, más que para teñir, con fines de microscopia, por sus propiedades bacterianas.

5.- Conclusión Se logró emplear la técnica adecuada para la realización de frotis microbianos, conociendo así mismo el mecanismo de acción de los distintos colorantes utilizados durante la práctica. También se logró operar de manera satisfactoria el microscopio, reconociendo cada una de sus partes, identificando algunas bacterias, como lo son estafilococos, estreptococos, estreptobacilos y cocobacilos, tiñéndolas en los distintos frotis realizados, con la técnica de iluminación Köhler.

6.- Cuestionario 1. ¿Cuál es la función de los Colorantes y en qué se fundamenta su uso en Microbiología? La función que tienen los colorantes es destacar morfología, estructura y distribución que presentan los microorganismos y así poder hacer observación de ellos en el microscopio óptico. Los colorantes básicos que se encuentran en disolución se cargan negativamente uniéndose a estructuras cargadas positivamente y no las células que tienen carga negativa. (Sales de Na. K, Ca, ión amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina ácida) Los colorantes básicos en disolución se cargan positivamente uniéndose a estructuras con carga negativa como las células. (Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina fenicada o carbol-fucsina) 2. Nombre los agentes usados y la acción propuesta para cada uno de los siguientes reactivos usados en la tinción Gram. a. Mordante: El lugol se adiciona para formar un complejo violeta-lugol (CV-I) con el fin de fijar el color en la bacteria, este Impide la salida del cristal violeta por la formación del complejo antes mencionado que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. 9

b. Color primario (tinción primaria): El color primario utilizado en la tinción de gram es el cristal violeta, el cual tiene cierta afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. c. Decolorante: El decolorante utilizado en la tinción es una mezcla de alcohol con acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano además de ser solubles en solventes orgánicos. d. Contra-tinción: La safranina funciona como un colorante secundario o de contra-tinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo (CV-I)

3. ¿Por qué se debe usar cultivos nuevos (de 24 horas o menos) para hacer la tinción Gram? Los cultivos que tienen más de 24 horas hacen que las bacterias tengan sus paredes celulares dañadas y esto hará que responderán de forma menos predecible a la tinción de Gram perdiendo su habilidad de retener el complejo CV-I. 4. ¿Qué parte de la célula bacteriana es la más involucrada en la tinción Gram y por qué? La parte involucrada en la tinción Gram es la pared celular. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las características involucradas en la tinción Gram.

Figura 5.- Esquema de las diferencias estructurales entre bacterias Gram negativas y Gram positivas. Tomada de: http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

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5. Describa la función y diferencia de los siguientes microscopios con respecto al microscopio óptico compuesto: Microscopio de fluorescencia, microscopio de contraste de fases y microscopio electrónico de barrido, microscopio electrónico de transmisión y microscopio confocal. Tabla 1.- Cuadro comparativo de microscopios Nombre Microscopio óptico compuesto

Función Examinar muestras muy pequeñas además de algunos de sus detalles muy finos.

Diferencia

Figura

Microscopio de fluorescencia

Microscopio de contraste de fases

Microscopio electrónico de barrido

Realizar técnicas con anticuerpos fluorecentes para detectar con rapidez e identificar microbios.

Utiliza colorantes fluorocromos, utiliza luz ultravioleta.

Observar detalladamente las estructuras internas de los microorganismos vivos.

No es necesario fijar ni teñir la muestra. Utiliza luz difractada.

Proporcionar imágenes tridimensionales con muestras con cortes más gruesos que con las muestras del microscopio electrónico de transmisión. Estudiar la estructura superficial de las células intacta de los virus.

Utiliza un haz primario de electrones

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Microscopio electrónico de transmisión

Microscopio confocal.

Examinar distintas capas de una muestra

Utiliza un haz de electrones en línea recta además de una rejilla de cobre en lugar de un portaobjetos

Obtener imágenes bidimensionales y tridimensionales de las células

Utiliza luz por láser. Utiliza colorantes fluorocromos

6. ¿Cuál es la iluminación más usada en la microscopia? La iluminación Köhler ya que esta elimina la luminiscencia dispareja en el campo de observación para que todas las partes de la fuente de luz contribuyan a la iluminación de la muestra que se esté observando. De la iluminación Köhler de se derivan 2 tipos: • •

iluminación Köhler transmitida: la luz es transmitida a través de la muestra (muestras transparentes o semitransparentes). Iluminación Köhler incidente: la luz es reflejada desde la muestra (objetivos como el metal, debido a que estos no transmiten luz).

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7. Haga un esquema de un microscopio señalando sus partes.

Figura 6.- Partes de un microscopio óptico compuesto. Obtenido de: https://docplayer.es/68415574-Tipos-de-microscopios.html 7.- Referencias • • • •

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• • •

Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Introduccin a la microbiologa (9a ed.). Buenos Aires: Mdica Panamericana. García, V. (1995). Introducción a la microbiología (2nd ed.). San josé, Costa Rica: Editorial Universidad Estatal a Distancia. Evelyn Cavallini. (2006). Bacteriología general. Costa Rica: Editorial: Universidad de Costa Rica. Eduardo Santambrosio. (2009). “Tinción y observación de microorganismos.” . Febrero, 2019, de UNIVERSIDAD TECNOLOGICA NACIONAL Sitio web: https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf Emilia Cercenado. (2010). Metodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. Febrero, 2019, de eimc Sitio web: https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimcprocedimientomicrobiologia37.pdf Pírez, M., & Mota, ...