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Med Clin (Barc). 2013;140(2):70–75

w w w . e l s e v i e r . e s / me di c i n a cl i n i c a

Revisio´n

Trampas extracelulares de neutro´filos: un mecanismo de defensa con dos caras Gabriela Camicia * y Gabriela de Larran˜aga Laboratorio de Hemostasia y Trombosis, Hospital de Infecciosas F. J. Mun˜iz, Buenos Aires, Argentina

I N F O R M A C I O´ N D E L A R T ´I C U L O

R E S U M EN

Historia del artı´culo: Recibido el 25 de enero de 2012 Aceptado el 19 de abril de 2012 On-line el 4 de julio de 2012

Los neutro´ filos desempen˜ an un papelclave en el sistema inmune innato, constituyendo la primera lı´nea de defensa del organismo. Recientemente se ha demostrado que adema´ s de eliminar pato´ genos mediante fagocitosis o secrecio´n de antimicrobianos, los neutro ´ filos pueden capturar y matar microorganismos a trave ´ s de la produccio´ n de estructuras extracelulares compuestas de ADN y proteı´nas antimicrobianas denominadas neutrophil extracellular traps (NETs, «trampas extracelulares de neutro´ filos»). Si bien cantidades fisiolo ´ gicas de NETs resultan importantes como agentes antiinfecciosos, valores altos en circulacio ´ n pueden resultar en una situacio ´ n fisiopatolo´ gica opuesta a la buscada, generando, por ejemplo, dan˜o tisular. Por otro lado, la excesiva formacio´n de NETs o alteraciones en su remocio´n se encontrarı´an asociadas al desarrollo de ciertas enfermedades autoinmunes. Esta revisio´n describe la estructura, funcio´n y generacio´ n de las NETs,y su posible implicanciaen la iniciacio ´ n y/o en el desarrollo de diversas enfermedades. ß 2012 Elsevier Espan ˜ a, S.L. Todos los derechos reservados.

Palabras clave: Trampas extracelulares de neutro´ filos Neutro´ filos Inmunidad innata

Neutrophil extracellular traps: a 2-faced host defense mechanism A B S T R AC T

Keywords: Neutrophil extracellular traps Neutrophils Innate immunity

Neutrophils play a key role in the innate immune system, providing the first line of host defense. In addition to their ability to eliminate pathogens by phagocytosis and antimicrobial secretions, it has recently been shown that neutrophils can trap and kill microorganisms by the release of extracellular structures composed of DNA and antimicrobial proteins called neutrophil extracellular traps (NETs). Although physiological amounts of NETs are important as antimicrobial agents, high levels of NETs in circulation may result in severe tissue damage. Besides, the excessive generation of NETs or a disruption in their clearance mechanism might be associated with the development of certain autoimmune diseases. This review describes the structure, function and generation of NETs, and their possible implication in the initiation and/or progression of different diseases. ß 2012 Elsevier Espan˜ a, S.L. All rights reserved.

´n Introduccio La respuesta inmune innata provee una defensa inmediata e inespecı´fica contra los agentes pato´ genos. Su papel principal consiste en restringir los microbios al sitio de infeccio´n, previniendo ası´ su diseminacio´ n sistema´tica. Los neutro´filos desempen˜ an un papel fundamental en el sistema inmune innato1 . Estas ce´lulas –altamente inflamatorias– son las primeras en ser reclutadas en el sitio de infeccio´n, constituyendo la primera lı´nea de defensa del organismo.

* Autor para correspondencia. Correo electro´nico: [email protected] (G. Camicia).

Se conocen 3 estrategias utilizadas por los neutro ´ filos para eliminar los microorganismos invasores: a) la fagocitosis, y subsiguiente eliminacio´n del pato´geno internalizado exponie´ndolo a un estallido oxidativo y a compuestos antimicrobianos que son descargados en las vacuolas fagocı´ticas por gra´ nulos citoplasma´ticos2 ; b) la degranulacio´n, que implica la liberacio´ n de sustancias antimicrobianas en el sitio de infeccio´ n, y c) la recientemente descrita liberacio´ n de estructuras en red de ADN y proteı´nas microbicidas al espacio extracelular, conocidas como neutrophil extracellular traps (NETs, «trampas extracelulares de neutro´ filos»)3. Estas trampas representan una estrategia de defensa para evitar la diseminacio´ n microbiana, conceny quiza´ promoviendo su trando la accio´n de los sinergismo.

0025-7753/$ – see front matter ß 2012 Elsevier Espan˜ a, S.L. Todos los derechos reservados. http://dx.doi.org/10.1016/j.medcli.2012.04.022

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En la presente revisio ´ n detallaremos la estructura, funcio ´n y mecanismos de formacio ´ n de NETs y sus consecuencias conocidas hasta el presente.

son una que Las encierra histonas y proteı´nas antimicrobianas, liberadas por los neutro´filos al espacio extracelular 3. Los , donde encuentran una concentracio´ n letal de agentes antimicrobianos (fig. 1 A y B). El ADN constituye la plataforma y el principal componente estructural de las NETs, dado que el tratamiento con ADNasas –pero no con proteasas– resulta en la desintegracio´n de estas estructuras3 . En estas trampas de ADN es posible encontrar varios durante la degranulacio´n de los neutro´filos, como ),

Figura 1. Trampas extracelulares de neutro´ filos (NETs). A) Imagen de microscopia de barridode NETs. B) Se muestra una imagen de bacterias atrapadas por NETs. Las ima´ genes fueron cedidas gentilmente por los Dres. Volber Brinkmann y Arturo Zychlinsky, del Max Planck Institute for Infection Biology, Alemania.

,

), l entre otros 4. Asimismo, las

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a, y incorporan la

Cabe mencionar que la liberacio´ n de NETs no se encuentra restringida solo a los neutro´filos. Se ha demostrado que los eosino´ filos y los mastocitos tambie ´ n son capaces de liberar trampas extracelulares6,7 . Las y/o una amplia variedad de microorganismos, s, entre los que se encuentran: Staphylococcusaureus, Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), Shigella flexeneri, Streptococcus pyogenes (S. pyogenes), Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans y Leishmania amazonensis 8–12 . Asimismo, se ha sugerido que las , las cuales resultan demasiado grandes para ser eliminadas mediante el mecanismo de fagocitosis10,13 . Como , la formacio´n de NETs ofrece ciertas ventajas respecto a la liberacio´ n de microbicidas por degranulacio´ n. Por un lado, , previniendo ası´ su diseminacio´n. Por otro lado, las NETs mantienen una alta concentracio´n de agentes antimicrobianos minimizando su difusio´n, lo que permite reducir el dan˜o causado por los microbicidas a los tejidos circundantes 14.

´ n de NETs es gatillada en respuesta a una La formacio variedad de estı´mulos proinflamatorios como lipopolisaca´rido bacteriano (LPS), interleucina-8 y miristato de forbol (PMA), ası´ como tambie´ n por bacterias, hongos yprotozoos. Se ha demostrado que algunos neutro´filos activados gatillan un programa de muerte celular –distinto de la apoptosis y la necrosis– que implica la disolucio´ n de la membrananuclear y de las membranas granulares, y la posterior descondensacio´ n de la cromatina en el citoplasma9 (fig. 2 A). Este mecanismo de muerte celular, recientemente denominado NETosis15 , permite que el contenido granular antimicrobiano y la cromatina se mezclen, posibilitando –luego de la ruptura de la membrana plasma´tica– la liberacio´ n al espacio extracelular de proteı´nas granulares ancladas a una red de cromatina (mecanismo directo). Este proceso lleva unas 2 o 3 h. En contraste con las ce´ lulas apopto ´ ticas, las ce´ lulas NETo´ ticas no muestran formacio´ n de vesı´culas de membrana, condensacio´n de la cromatina nuclear, fragmentacio´n de ADN, ni exposicio´n de fosfatidilserina previa a la ruptura de la membranaplasma´ tica16 . La liberacio´ n de NETs no solo es gatillada por pato´ genos y sus componentes, sino tambie´n por plaquetas activadas con LPS o el plasma de pacientes se´ pticos (mecanismo indirecto) (fig. 2 B). Durante la sepsis grave, las plaquetas pueden inducir la activacio´ n de neutro´filos secuestrados en la microvasculatura vı´a Toll-like receptors (TLR4, «receptor tipo Toll 4»), conduciendo a la formacio´n de NETs17. En contraste con el mecanismo directo, el mediado por plaquetas activadas puede llevar apenas unos minutos en condiciones de flujo constante. Estas NETs atrapan bacterias presentes en la circulacio´ n siste´mica, aunque ocasionan dan˜o endotelial 17 . Finalmente, seha demostrado que neutro´filos incubados con de colonias granulomonocı´ticas y subsiguiente estimulacio´ n con el componente del son capaces de liberar NETs compuestas de ADN mitocondrial6 . Estas NETs obviamente carecen de histonas e indican que la produccio´ n ´ n de ADN de NETs nosiempre involucra muerte celular. La liberacio mitocondrial al espacio extracelular puede tambie´n activar neutro´filos, actuando como un ligando para el receptor TLR918 .

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A

Activación directa del neutrófilo

Microorganismo

B

NET

Activación indire cta del neutrófilo mediada por célula Microorgani smo LPS Plaqueta TLR4

C

NET

Trampa s extracelulares de eo sinófilos ET

Figura 2. Mecanismos de formacio´ n de trampas extracelulares. A)La estimulacio´ n directa de neutro´ filos por microorganismos o miristato de forbol conduce a laformacio´ n de trampas extracelulares de neutro´ filos (NETs), lo que resulta en la muerte del neutro´filo. B) Bajo condiciones de flujo, las plaquetas activadas vı´a lipopolisaca´ rido bacteriano ´ n de los neutro´filos, seguido de la liberacio´ nde NETs.C) La activacio´ n de eosino´ filos, vı´a LPS, puede liberar el ADN mitocondrial para formar trampas (LPS)inducen la activacio 4 extracelulares similares a las NETs. Adaptada de Papayannopoulos y Zychlinsky .

Asimismo, se ha descrito que los eosino´ filos son capaces de liberar estructuras parecidas a las NETs compuestas por ADN mitocondrial y proteı´nas granulares6 (fig. 2 C). ´ n de trampas de formacio extracelulares de neutro´filos Au´n son poco claros los mecanismos moleculares involucrados en la formacio´n de NETs, pero varias lı´neas de evidencia demuestran que la generacio´n de especies reactivas de oxı´geno (ERO) por la ˜ a un rol central. La inhibicio´ n farmacoNADPH oxidasa desempen lo´gica del estallido respiratorio luego del tratamiento de neutro´filos con difenileniodonio –inhibidor de la NADPH oxidasa– perjudica notablemente la formacio´n de NETs9 . De hecho, los neutro´filos aislados de pacientes con la 9,19. La EGC es una inmunodeficiencia grave causada por mutaciones en los genes que Como codifican para las subunidades de la consecuencia, los pacientes con EGC son incapaces de producir ERO 20 y son susceptibles a infecciones oportunistas recurrentes. En ´ nica de subunidades este sentido, la introduccio´n por terapia ge activas de la NADPH oxidasa en un paciente con EGC fue capaz de restaurar la habilidad de los neutro´filos del paciente de liberar NETs y resolver una aspergilosis recalcitrante 13.

Recientemente, se propuso un modelo donde el estallido oxidativo inducirı´a la liberacio´n de NE y, subsecuentemente, de ´ n el modelo descrito, la NE MPO de los gra´ nulos azuro´ filos. Segu translocarı´a hacia el nu ´ cleo, donde se encargarı´a del clivaje de histonas y promoverı´a la descondensacio´ n de la cromatina, mientras que la MPO colaborarı´a sine´rgicamente con la NE en las etapas finales del proceso de decondensacio´n del ADN21 (fig. 3). No obstante, estudios recientes sugieren que la formacio´n de NETs puede tener lugar de modo independiente de ERO22,23 . Se ha descrito que la estimulacio´n de –pero no con PMA– induce la de modo independiente de la actividad de la e involucrando cinasas de la familia Src22 . Co ´ mo escapar de las trampas Algunas bacterias logran escapar de las NETs desarrollando estrategias de fuga basadas en la degradacio´ n de la red de ADN mediante la sı´ntesis de ADNasas. Se ha demostrado que la expresio´n de la ADNasa Sda1 por S. pyogenes es un atributo de virulencia importante, dado que las cepas deficientes en Sda1 son in vitro ma ´ s sensibles a las NETs que las cepas que producen activamente la ADNasa 24 . Ma´s au´ n, la transformacio ´ n de Lactococcus lactis con un pla´ smido portador del gen que codifica para

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Figura 3. Modelo molecular de formacio´ n de trampas extracelulares de neutro´filos (NETs). Cuando el neutro´ filo esta´ en reposo, la elastasa del neutro´filo (NE) y la ´ n y la produccio´ n de especies reactivas de oxı´geno, la NE y la MPO actu´an mieloperoxidasa (MPO) son mantenidas en los gra´nulos azuro´ filos. Luego de la activacio 21 cooperativamente en la descondensacio´ n de la cromatina, llevando a la ruptura de la ce´lula y a la liberacio´ n de NETs. Adaptada de Papayannopoulos, et al.

Sda1 aumenta la resistencia bacteriana a la destruccio´n extracelular mediada por NETs 24. Sin embargo, el hecho de que las ADNasas requieran cationes divalentes como Ca++ y Mg++ para su actividad, provee un potencial punto de ataque por parte del hospedador. Recientemente, se ha descrito que las proteı´nas quelantes de calcio y cinc S100 se encuentran presentes en altas concentraciones en los sitios de infeccio´ n25 . Es probable, entonces, que la capacidad de unir Ca++ de algunas proteı´nas como S100, anexinas y otras, protejan las NETs de las ADNasas bacterianas, limitando la disponibilidad de cationes divalentes y, consecuentemente, la actividad de las ADNasas. Las bacterias tambie´ n podrı´an utilizar catalasas para inhibir la formacio´ n de NETs dependiente de ERO. De hecho, se ha descrito ´ n de NETs. que la inhibicio´ n de las catalasas incrementa la formacio Resulta probable, entonces, que los microbios empleen catalasas para evitar ser atrapados por las NETs9 . Asimismo, algunas bacterias pueden esconderse en biofilms como un mecanismo de resistencia a los microbicidas contenidos en las NETs26. Finalmente, la modificacio´n de la superficie bacteriana serı´a otra de las estrategias empleadas por las bacterias para evadir las NETs. Se cree que la unio´n de las NETs a los microorganismos blanco estarı´a dada a trave´s de interacciones electroesta´ticas entre las superficies anio´ nicas microbianas y las proteı´nas catio ´ nicas incrustadas en las NETs. En este sentido, la expresio´n de ciertos genes involucrados en el ensamblado de la ca´ psula bacteriana de S. pneumoniae disminuye la unio´ n a las NETs. El opero´ n dlt de S. pneumoniae introduce carga positiva en la pared celular con la incorporacio ´ n de residuos de D-alanina en el a´cido lipoteicoico. Si bien la inactivacio´ n del dltA no afecta la unio ´ n bacteriana a las NETs, se observo´ que, en ausencia de ca´psula, la inactivacio´ n del dltA aumenta la muerte bacteriana mediada por NETs, sugiriendo que un cambio en la carga de superficie permitirı´a la penetracio ´n de los antimicrobianos incluidos en las NETs27. No todo es beneficioso Cualquier proceso fisiolo ´ gico necesita ser controlado por ´ n, todo proceso fisiolo ´ gico mecanismos estrictos. Sin regulacio puede tener consecuencias patolo´ gicas serias. Las NETs no son una excepcio´n. Si bien cantidades fisiolo´gicas de NETs resultan importantes como agentes antiinfecciosos en la respuesta inmune innata, altos niveles aberrantes de NETs en circulacio´n pueden ´ gica opuesta a la buscada, resultar en una condicio´ n patofisiolo generando, por ejemplo, microtrombos en capilares, deterioro de la microcirculacio´n y dan˜o tisular 28.

En ciertos pacientes con enfermedades autoinmunes como lupus eritematoso siste´mico (LES) o vasculitis siste´ mica, se producen grandes cantidades de autoanticuerpos contra ADN de doble cadena (dcADN), contra histonas y contra MPO29. Dado que estas mole´ culas son abundantes en las NETs, se creeque estas NETs podrı´an tener un rol en el desarrollo de alguna de estas enfermedades autoinmunes4 . El LES es una enfermedad autoinmune caracterizada por la pe´rdida de tolerancia hacia los antı´genos nucleares, la deposicio´ n de complejos autoinmunes en los tejidos y dan˜os en mu´ ltiples tejidos 30. Se ha sugerido que en los pacientes con LES los autoanticuerpos activarı´an neutro´filos, promoviendo la liberacio´n de NETs. Estas NETs activarı´an ce ´ lulas dendrı´ticas plasmocitoides y conducirı´an a la liberacio´ n de interfero´n-a y a la exacerbacio´ n o perpetuacio´ n de la inflamacio´ n y la enfermedad30 . Adema´s, se pudo demostrar que ciertos pacientes con LES muestran una degradacio ´ n lenta de las NETs in vitro, posiblemente debido a la presencia de ciertos inhibidores de ADNasas propias o anticuerpos que protegen las NETs. Aquellos pacientes que presentan una alteracio´ n en la degradacio´ n de las NETs desarrollan nefritis lu´pica 31. En consecuencia, la disrupcio´n del mecanismo de limpieza o clearance de NETs se encontrarı´a asociado con la autoinmunidad. En este sentido, se han descrito mutaciones inactivantes en el locus de la ADNasa I humana en 2 cohortes de pacientes con LES en Corea y Japo ´ n32,33 , y ma ´ s recientemente se ha encontrado una asociacio´ n entre un polimorfismo de un solo nucleo´tido en la ADNasa I y la susceptibilidad al LES en unestudio ˜ ola 34 . Por lo tanto, la ADNasa I realizado en la poblacio´n espan humana desempen ˜ arı´a un papel en la remocio ´ n de las NETs. En tal caso, mutaciones en el gen que codifica para la ADNasa podrı´an conducir a la persistencia de NETs, seguido de un episodio de infeccio´ n, y tal vez incrementar las chances de iniciar autoinmunidad. En concordancia con esta hipo´tesis, se ha descrito una correlacio´ n entre un incremento en la produccio´ n de anticuerpos antinucleares y un aumento en el nivel de dcADN extracelular en ˜ os infectados con Plasmodium falciparum (P. sangre en nin falciparum)35 . La formacio ´ n de NETs y la produccio´ n de autoanticuerpos antinucleares contra dcADN –junto con el perfil de ˜ os infectados con P. citocinas encontrado– sugieren que en los nin falciparum mecanismos autoinmunes podrı´an inducir patologı´a35 . Se ha descrito que autoanticuerpos citoplasma´ticos antineutro´filos (ANCA) derivados de pacientes con vasculitis de pequen˜os vasos inducen la formacio´n de NETs in vitro. Tanto la MPO como la PR3 son blanco de los ANCA, y se cree que la activacio´ n de los neutro´filos se gatilla por la interaccio´n de estos anticuerpos con la MPO y la PR3, que se localizan en su superficie36.

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G. Camicia, G. de Larran˜aga / Med Clin (Barc). 2013;140(2):70–75

Quedan au´ n muchos enigmas por descifrar asociados a las NETs y el desarrollo de autoinmunidad; sin embargo, la excesiva formacio ´ n de NETs o su persistencia desempen˜arı´an un papel fundamental en algunas enfermedades autoinmunes. No esta´ claro au ´ n si la disfuncio´n pulmonar grave u otras enfermedades en conjuncio´n con infecciones virales podrı´an ser parcialmente debidas a las NETs como consecuencia de la arrolladora respuesta inflamatoria37,38 . Las NETs contribuirı´an a la patologı´a de la fibrosis quı´stica previniendo no solo ...