TUTORIA CON MAFALDA HOKINGS PDF

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LO TRABAJADO DURANTE LAS TUTORIAS DE ESA PERRI DE PROFESROA QUE OS VA A JODRER VIVOS...

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Estudio del sistema del complemento Verónica de la Haba Gavilán

1. INTRODUCCIÓN Cuando hablamos del complemento nos estamos refiriendo a una o varias sustancias que son necesarias para completar la realización de algunas reacciones antígenoanticuerpo. Si se produce su activación se provoca la estimulación de: - La inflamación. - La lisis celular. - La fagocitosis. - La quimiotaxis de los polimorfonucleares.

2. COMPLEMENTO COMO PARÁMETRO Los componentes del complemento los podemos medir de dos formas que a continuación vamos a estudiar: a. Mediante la metodología de determinación de proteínas podemos detectar la presencia del complemento como un antígeno, lo que no quiere decir que sea funcionalmente activo. Expresamos el resultado como una concentración de la proteína estudiada. Debemos tener en cuenta que existen múltiples defectos genéticos de una o varias proteínas del complemento. Estos múltiples defectos van acompañados de varias manifestaciones clínicas. b. La segunda forma de medir los componentes del complemento es a través de una cuantificación de su actividad biológica. Esta medición se basa en la capacidad del suero para lisar glóbulos rojos recubiertos de anticuerpos.

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Las alteraciones en la actividad de uno o varios componentes van a producir algunas alteraciones en el resultado. Su valor se expresa en unidades arbitrarias.

3. COMPLEMENTO COMO REACTIVO Cuando se utiliza el complemento como reactivo es para demostrar que ha ocurrido la reacción antígeno-anticuerpo. Con este fin se usa en: - Valoración de destrucción celular con colorantes vitales. Los colorantes vitales son captados por las células vivas pero sin embargo no son captados por las células muertas. Un ejemplo de un colorante vital es la nigrosina. Por tanto, si en la muestra existen anticuerpos frente a esas células y éstas se ponen en contacto en presencia de complemento se produce la lisis celular y la no captación del colorante. Como resultado de la prueba se determinará el tanto por ciento de lisis. - Determinación de inmunocomplejos. Los inmunocomplejos circulantes se pueden poner de manifiesto por la capacidad de fijación que tienen. - Técnica de fijación del complemento.

4. COMPLEMENTO COMO INTERFERENCIA ANALÍTICA Debido a la labilidad del complemento y a que no posee una concentración constante, si la técnica en cuestión no utiliza el complemento como reactivo, podemos observar que su presencia irregular puede producir una alteración de los resultados. Es por éste motivo que en la mayoría de las técnicas inmunológicas, se requiere como paso previo descomplementar o inactivar el suero, es decir, eliminar dicha variable del ensayo reduciendo la actividad complementaria de la muestra a cero. Una forma para conseguir que los sueros se deplecionen de actividad complementaria es incubando a 56ºC durante media hora.

5. CONDICIONES DE EXTRACCIÓN. MANEJO DE MUESTRAS Debemos de tener mucho cuidado a la hora de manejar las muestras ya que un inadecuado manejo de las mismas nos llevaría a un gran número de errores en las determinaciones del complemento. Debido a la labilidad de algunos factores del complemento, debemos de considerar la recolección y el almacenamiento de las muestras como algo crítico.

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No debemos utilizar el plasma porque los quelantes y la heparina son anticomplementarios. Utilizamos el suero. El manejo de las muestras varía según la técnica que utilicemos, pero como norma general recordamos: - Si vamos a realizar el proceso de la muestra antes de las 6 siguientes horas (mejor antes de 3 horas) a su extracción podemos dejar el suero a temperatura ambiente. - Si lo que queremos realizar es una determinación no funcional podemos guardarlo durante 24 horas en la nevera. - En cuanto nos sea posible debemos separar el suero del coágulo. - Si no vamos a procesar el suero antes de 24 horas en las de medición de la actividad o inmediatamente después a su extracción en las determinaciones de actividad debemos de separar el coágulo lo más pronto nos sea posibles y además debemos de almacenarlo a una temperatura de -70º C. - Cuando la técnica que estemos llevando a cabo necesite que se hagan diluciones, éstas diluciones deben realizarse con suero salino frío y además deberá estar guardado en una nevera. - Las muestras sólo debemos descongelarlas una vez ya que si descongelamos y congelamos las muestras sucesivamente estamos provocando un deterioro del complemento. Otro factor importante a tener en cuenta es el suero control o estándar que vayamos a utilizar en la muestra. Los sueros suelen presentarse en forma de liofilizados. Cuando vayamos a realizar la reconstitución de los controles debemos de hacerlo con agua destilada previamente enfriada a 4º C y una vez que lo hayamos reconstituido debe repartirse en alícuotas además de almacenarse a -70º C. Como ya hemos comentado anteriormente una vez descongelado no debemos congelarlo otra vez.

6. PARÁMETROS DE LABORATORIO 6.1. SIGNIFICACIÓN. En cuanto a su significación tenemos: - Medida de actividad. Ensayo hemolítico total CH100 o CH50. Es una medida genérica que sirve como prueba de valoración global. Lo que medimos es la actividad hemolítica del complemento que ha sido activado por la vía clásica. Esta medida no puede detectar pequeños defectos. - C3 y C4. Son fracciones mayoritarias. Al estudiar su concentración y en función del valor obtenido, nos va a decir la vía por la cual se ha activado

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el complemento que puede ser por vía clásica (consumo de C3 y C4) o por vía alterna (consumo de C3). - Déficit de inhibidor de la C1 esterasa. Cuando se observa ausencia de este factor siempre es asociado con el edema angioneurótico. - Factor properdina. El factor properdina se consume en caso de activación por la vía alterna. - Ensayos funcionales de los distintos componentes. Estos ensayos habitualmente se suelen realizar en laboratorios especializados y consiste en reproducir la secuencia del ensayo hemolítico, pero añadiendo en exceso todos los componentes excepto el componente que va a medirse.

6.2. TÉCNICAS. En cuanto a las técnicas en el estudio del complemento encontramos.

6.2.1. CH100. Técnica de inmunodifusión radial. La prueba realiza una inmunodifusión del suero problema sobre una placa de agarosa que incluye hematíes sensibilizados. El complemento difunde en la agarosa y reacciona con los hematíes sensibilizados produciéndose la hemólisis. Primero podemos realizar una inmunodifusión en frío a 4ºC y después incubar a 37º, 30 ó 60 minutos, o bien realizar la difusión y la hemólisis al mismo tiempo incubando las placas a 37º durante 6 horas. Se lee el diámetro del halo de hemólisis total y se compara con una curva de calibración realizada por medición de diámetros de estándares con concentración de complemento conocida. Realizamos la representación gráfica del cuadro de los diámetros frente a las actividades o bien la actividad frente al diámetro en papel simologarítmico. Los rangos de diferencia varían de un sistema a otro con respecto a los valores obtenidos con CH50.

6.2.2. CH50. La unidad de medida CH50 se define como el inverso de la dilución más alta (de la cantidad de suero necesaria) para lisar el 50% de glóbulos rojos sensibilizados en unas condiciones estandarizadas. La prueba consiste en la detección de la hemólisis de hematíes de carnero mediada por anticuerpos específicos de conejo en presencia de la secuencia intacta del complemento tras incubación de una hora a 37º.

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La hemólisis se mide por espectrofotometría como media de la hemoglobina liberada (medida a 541 nm). La lisis describe una curva sigmoide cuya zona central es prácticamente lineal. Por ello se expresa habitualmente como CH50, porque en dicha zona la relación cantidad efectiva de complemento-hemólisis es más sensible a cambios mínimos. Son varios los parámetros que debe tener la reproductividad de la técnica: - Concentraciones de Ca y Mg. - Fuerza iónica y pH del tampón. - Recogida y almacenamiento de la muestra. - Concentración y vejez de los hematíes. - Tiempo de reacción y temperatura. - Cantidad y calidad de la hemolisina. La forma de expresión más habitual es la de Von Krogh. Ésta transforma la curva en una línea recta. Log X = log K + 1/n log (y/[1-y])

Fig. 19.1. Representación del porcentaje de hemólisis frente a la concentración de complemento.

Donde: X = mL de suero diluido que son añadidos. y = al grado o porcentaje de lisis. K = constante. n = 0,2 en condiciones estándar.

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Fig. 5.2. Representación de la ecuación de Von Krogh.

Esta técnica puede presentar dos problemas principales: - Dificultad de estandarización por lo que cada laboratorio debe definir sus valores y adaptarlos a sus condiciones de trabajo. - Baja sensibilidad. Es preciso una reducción considerable de componentes para dar resultados patológicos. Para ello se usa como fuente de complemento para el control suero fresco de cobaya.

6.2.3. C3 y C4. Con el mismo fundamento que cualquier otro antígeno, pueden cuantificarse por: - Inmunodifusión radial. - Nefelometría. - Turbidimetría. La medición puede hacerse frente a un estándar distinto de lo que estamos midiendo por lo que hay que poner atención en la estandarización. La mejor forma de estandarizar es hacerlo frente a sueros comerciales preparados con grandes “pooles” de donantes normales.

6.2.4. Otros factores. - Factor properdina. Se determina por nefelometría. - Inhibidor de la C1 esterasa. Se determina por inmunodifusión radial.

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7. INTERPRETACIÓN Para poder interpretar los resultados obtenidos en el estudio del sistema del complemento, tenemos que referirnos tanto al aumento de la actividad como a la disminución de ésta. La hiperproducción es el origen del aumento de la actividad. Este aumento se puede apreciar en enfermedades inflamatorias e infecciosas como el reumatismo poliarticular, periarteritis nodosa, infarto agudo de miocardio, artritis reumatoide, fiebre tifoidea, dermatomiositis, etc. En cuanto a la disminución de la actividad global, los mecanismos etiológicos son diversos: - Consumo. - Disminución de síntesis. - Aumento del catabolismo. - Presencia de inhibidores. La reducción de C3 se correlaciona con niveles bajos de CH50. En déficit de vía clásica disminuyen C1, C2, C3 y C4. Esto suele ocurrir sobre todo en enfermedad del suero, crioglobulinemias mixtas, LES y en enfermedades con inmunocomplejos circulantes. En la vía alterna desciende el C3 y el factor B pero no existe disminución de C1, C2 ni C4. Suele ocurrir especialmente en las septicemias por gérmenes gramnegativos y en las glomerulonefritis membranoproliferativas.

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