UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 200 8 Recopilado y revisado por PDF

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1 UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 200 8 Recopilado y revisado por: ALEJANDRO MARTINEZ M. GLORIA AMPARO VALENCIA P. NORA JIMENEZ U. MONICA MESA ELKIN GALEANO J. Medellín, Mayo de 2008 ...

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UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 200 8

Recopilado y revisado por: ALEJANDRO MARTINEZ M. GLORIA AMPARO VALENCIA P. NORA JIMENEZ U. MONICA MESA ELKIN GALEANO J.

Medellín, Mayo de 2008

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PROGRAMA DEL CURSO DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA 200 8 Objetivo general ♦ Al finalizar el curso el estudiante estará en capacidad de evaluar, extraer, aislar, caracterizar e ident ificar sustancias naturales de origen biológico.

Temas del curso 1. INTRODUCCIÓN. Duración: 6 Horas ♦ Presentación del curso ♦ Entrega de Equipos ♦ Normas de laboratorio 2. RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA. TAXONOMIA VEGETAL. PRESENTACIÓN DE UN EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIÓN. Duración: 6 Horas 3. RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS. Duración: 6 Horas 4. TECNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN (CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA). Duración: 12 Horas 5. RECONOCIMIENTO DE ADULTERACI ONES Y/O FALSIFICACIONES (OBSERVACIÓN DE DROGAS PULVERIZADAS). Duración: 6 Horas 6. RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA. Duración: 6 Horas 7. FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES). Duración: 12 Horas 8. TECNICAS GENERALES DE E XTRACCIÓN Y VALORACION DE UNA DROGA Duración: 12 Horas 9. MARCHA FITOQUIMICA. Duración: 18 Horas

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10. PRACTICA ESPECIAL. Duración: 60 Horas ♦ Revisión bibliográfica y elaboración de un anteproyecto. Duración: 12 Horas ♦ Trabajo en el Laboratorio (Desarrollo exper imental). Duración: 36 Horas ♦ Póster: Elaboración 6 Horas, Presentación: 6 Horas ♦ Contenido: Elaboración de un fitofármaco. Aislamiento y caracterización de metabolitos secundarios. PRESENTACIÓN Este MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMCA 200 8, corrige y modifica parcialmente el manual publicado en marzo de 2003 (ISBN 958 -655-682-4). CONTENIDO Pág. PRACTICA No. 1 PRACTICA No. 2 PRACTICA No. 3 PRACTICA No. 4 PRACTICA No. 5

RECONOCIMIENTO DE LA FLORA UNIVERSITARIA, TAXONOMÍA VEGETAL, PRESENTACIÓN DE UN EJEMPLAR CON SU CLASIFICACIÓN RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS TÉCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN (CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y EN COLUMNA) RECONOCIMIENTO DE ADULTERACIONES Y/O FALSIFICACIONES (OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE DROGAS PULVERIZADAS) RECONOCIMIENTO CROMATOGRÁFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJENJO RECONOCIMIENTO POR CCF DEL AJO RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALCACHOFA RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA ALBAHACA RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA HIERBABUENA RECONOCIMIENTO POR CCF DEL HINOJO RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MALVA RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA MANZANILLA

19 5 22 38 38 38 39 40 40 41 42 43

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PRACTICA No. 6 PRACTICA No. 7

PRACTICA No. 8 PRACTICA No. 9

MATRICARIA RECONOCIMIENTO PO R CCF DEL ROMERO RECONOCIMIENTO POR CCF DE LA SABILA RECONOCIMIENTO POR CCF DE FLORES DE SAUCO RECONOCIMIENTO POR CCF DE HOJAS DE TORONJIL RECONOCIMIENTO POR CCF DE VALERIANA FENILPROPANOS (ACEITES ESENCIALES)

43 44 45 45 46 47

TÉCNICAS GENERALES DE EXTRACCIÓN Y VALORACIÓN DE UNA DROGA: VALORACION DE ALCALOIDES DEL TROPANO, VALORACION DE RUTINA, VALORACION DE ANETOL

52

MARCHA FITOQUÍMICA

68

PRACTICA ESPECIAL

-

Pautas para la elaborac ión del informe de laboratorio

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PRACTICA N° 2 RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS OBJETIVO Distinguir y clasificar los diferentes metabolitos secundarios presentes en el tejido vegetal por medio de pruebas químicas de coloración y precipitación. Consultar: Domínguez, X. 1973.Capítulo 3.

A.,

“Métodos

de

Investigación

Fitoquímica”,

Ed.Limusa,México,

MARCO TEÓRICO Metabolitos Primarios: Son los productos químicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo vital de todo ser vivo, son: lo s carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos. Metabolitos Secundarios: Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas metabólicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro de un grupo taxonómico, estado de vida o tejido presentando una distribución restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonomía. Su ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patógenos, predadores, cambios térmicos o l umínicos, deficiencias nutricionales o presencia de otros organismos intra o interespecíficos. El metabolismo secundario es una característica fundamental de la especialización, es decir que el compuesto resultante, puede no ser importante para la célula pero sí para el organismo como un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel esencial en los procesos fisiológicos del organismo. Algunos metabolitos secundarios son “residuos bioquímicos”, es decir, productos de activ idad enzimática de substratos no apropiados o productos de destoxificación o desecho de importancia para la supervivencia y la buena condición de los organismos. Con pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de cinco grupos, de acuerdo con su base biosintética: fenilpropanos, acetogeninas, terpenoides, esteroides y alcaloides. Reconocimientos de Metabolitos: El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas fitoquímicas preliminares, las cuales son una prueba química de caracterización consistente en una reacción química que produce alteración rápida en la

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estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificación de un grupo funcional, la apertura de un sistema anular, la formación de un ad ucto o un complejo, lo cual da por resultado una manifestación sensible como el cambio de un color, la formación de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dándonos indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular. • Reconocimiento de Alcaloides: Los alcaloides son sustancias básicas que contienen nitrógeno en un anillo heterocíclico, son derivados de aminoácidos, presentan distribución taxonómica limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de un ácido org ánico.

N CH3 N

Nicotina Atendiendo a su solubilidad, propiedad empleada para extraerlos y purificarlos, la base del alcaloide es soluble en solventes orgánicos y pueden formar sales solubles en solventes polares cuando se encuentra en ácidos minerales diluidos. •

Reconocimiento de Flavonoides: (+)-Catequina O

OH

Los Flavonoides son compuestos polifenólicos con quince átomos de carbono, cuya estructura consta de 2 anillos de benceno unidos por una cadena lineal de tres carbonos. El esqueleto de los flavonoides se representa por el sistema C6 – C3 – C6. • Reconocimiento de Cardiotónicos: Una aglicona cardiotónica, estructuralmente esta constituida por el sistema anular esteroidal (ciclo pentano perhidrofenantreno) con los grupos metilos C–18 y C-19,

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un grupo hidroxilo en el carbono 3 y un anillo lactónico carbonos unido al carbono 17 del núcleo esteroidal.

α-β insaturado de cuatro O O

Digoxin

H3 C H

OH CH3

O

O CH3

3

OH

OH O

Estas agliconas toman el nombre de cardenólidas por presentar acti vidad estimulante sobre el músculo cardiaco, cuando están en forma de glicósidos. • Reconocimiento de Saponinas: Las saponinas son un grupo de glicósidos solubles en agua, que tienen la propiedad de hemolizar la sangre y disminuir la tensión superficial d el agua, formando espuma abundante. Las saponinas por hidrólisis se desdoblan en carbohidratos y una aglicona llamada sapogenina. CH3 O

H3C CH3 O CH3

Diosgenina HO

La sapogenina puede tener el sistema anular esteroidal o el de un triterpeno pentacíclico. Los anillos E y F de la saponina estereoidal conforman el llamado sistema espirostanal. El en lace glicosídico siempre se forma con el oxigeno del carbono 3.

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• Reconocimiento de Cumarinas: Las cumarinas son un grupo muy amplio de principios activos fenólic os y tienen en común la estructura química de 1 -benzopiran-2-ona. Se caracterizan porque presentan fluorescencia bajo la luz ultravioleta a 365 nm.

O •

O

Reconocimiento de Taninos:

Los taninos son productos de excreción de muc has plantas, involucrados en mecanismos de defensa de las mismas, contra organismos parásitos. Se encuentran más comúnmente en hojas, ramas y debajo de la corteza. Químicamente los taninos son polímeros de polifenoles, sustancias con alto peso molecular (comprendido entre 500 a 3000), se clasifican en: Taninos Hidrosolubles o Pirogálicos: Son ésteres fácilmente hidrolizables formados por una molécula de azúcar (en general glucosa) unida a un número variable de moléculas de ácidos fenólicos (ácido gálico o su dímero, el ácido elágico). Son comunes de observar en plantas Dicotiledóneas. OH

OH COOH

O

OH

Ác. Gálico

HO

O

Leucoantocinidina HO OH

OH

Ác. Elágico

OH HO

O

OH

OH

Flavan 3,4-diol Leucopelargonidin

OH

Taninos no Hidrosolubles ó Condensados : Tienen una estructura química similar a la de los flavonoides. Por hidrólisis dan azúcar y ácido elági co, algunos taninos condensados son conocidos como pro -antocianidinas porque por hidrólisis ácida producen antocinidinas y leucoantocinidinas.

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•

Reconocimiento de Esteroides y/o Triterpenoides: CH3 H3C

CH3

CH3 CH3 CH3

Ergosterol

HO

Los esteroides son compuestos cuya estructura presenta el sistema anular del ciclopentano perhidrofenantreno, metilos en los carbonos 10 y 13 y un radical lineal en el carbono 17. • Reconocimiento de Quinonas: Las quinonas son dicetonas cíclicas insaturadas que por reducción se convi erten en polifenoles, siendo reversible esta reacción. Las quinonas derivan su nombre del miembro más simple de la serie: la p -benzoquinona obtenida en 1838 por Woskresensky, como producto de oxidación del ácido quínico. O

O

Antraquinona

Las quinonas, por el sistema aromático que dan al reducirse se pueden clasificar en Benzoquinonas, Naftoquinonas, Antraquinonas (las más numerosas) y Fenantroquinonas (las menos numerosas). • Reconocimiento de Antocianinas: Las antocianinas son pigmentos fla vonoides que se comportan como indicadores ácido – base debido al proceso:

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Pelargonidina

HO

O

HO

+

OH

pH < 3 Catión cianina

HO

O

HOOH

O

O

OH

O

HO-

H+

OH OH

pH 8.5 Base cianina

-

H+

O OH

pH > 11 Anión cianina

Estos pigmentos suelen presentarse en forma de glucósidos, lo que explica su solubilidad en agua y la fácil extractabilidad por solventes acuosos. Se encuentran en la savia de las plantas, y a menudo en forma de sólidos amorfos o cristalinos en las hojas de tejido leñoso y frutos. Su color esta algunas veces enmascarado pro otros pigmentos, como la clorofila.

Procedimiento Experimental 1. Recolectar y preparar las muestras frescas 2. Reconocimiento de alcaloides Desmenuzar finamente en un mortero, unos 10 g. de muestra fresca y colocarlos en un erlenmeyer. Añadir un volumen suficiente de HCl al 5% para que toda la muestra esté en contacto con la solución ácida. Calentar con agitación al baño maría durante unos 5 minutos. Enfriar. Filtrar. Colocar en 4 tubos de ensayo 2 ml de filtrado ácido frío. Añadir a cada uno 2 gotas de los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Si se observa turbidez o precipitados en por lo menos 3 tubos, se considera que la muestra contiene alcaloides. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biológica, ensayar con un estándar de quinina en solución ácida. 3. Reconocimiento de Flavonoides. Leucoantoc ianidinas y Cardiotónicos En un erlenmeyer colocar unos 10 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Añadir un volumen suficiente de alcohol etílico que cubra toda la muestra y le confiera fluidez. Calentar al baño maría durante unos 5 minutos, con agita ción. Enfriar. Filtrar. Si hay presencia de clorofilas, al filtrado añadirle un volumen igual de solución de acetato de plomo al 4% que contenga ácido acético al 0.5 %,

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agitar, dejar reposar 15 minutos y filtrar. Con el filtrado realizar ensayos de reconocimiento de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotónicos. a) Ensayo para flavonoides Colocar varias limaduras de magnesio en un tubo de ensayo. Añadir unos 2 ml del filtrado y por la pared del tubo, gota a gota dejar caer varias gotas de HCl concentrado. La aparición de colores naranja, rosado, rojo o violeta es prueba positiva para la existencia de flavonoides en la muestra. Nota: antes de realizar el ensayo con la muestra biológica, ensayar con un estándar de rutina o quercetina en solución acuo -alcohólica. b) Ensayo para Leucoantocianidinas Colocar unos 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Añadir 1 ml de ácido clorhídrico concentrado. Calentar en baño de agua hirviendo durante 15 minutos. La aparición de coloraciones rojas es prueba positiva d e la existencia de leucoantocianidinas en la muestra. c) Ensayo para Cardiotónicos En un tubo de ensayo colocar 1 ml de filtrado. Añadir 0.5 ml de Reactivo de Kedde (mezclar 1 ml de solución A con 1 ml de solución B para preparar este reactivo antes de su uso). La aparición de coloraciones violetas o púrpuras es prueba positiva de la existencia de cardiotónicos en la muestra. 4) Ensayo para saponinas Desmenuzar con ayuda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtr ar. Agitar en un tubo de ensayo tapado, unos 4 ml de filtrado acuoso, vigorosamente durante un minuto. La formación de una espuma abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra. 5) Ensayo para taninos Desmenuzar con ay uda de un mortero unos 10 g de muestra fresca, con ayuda de unos pocos ml de agua. Filtrar. Tomar 1 mL de filtrado acuoso en un tubo de ensayo. añadir 1 ml del Reactivo Gelatina -Sal. Si se forma un precipitado, centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos. Des echar el sobrenadante. Redisolver

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el precipitado en 2 mL de Urea 10M. Añadir 2 -3 gotas de solución de cloruro férrico al 10%. La formación de precipitado al agregar el reactivo de gelatina, y la aparición de colores o precipitados verdes, azules o negros e s prueba positiva de la presencia de taninos en la muestra. 6) Ensayo para Triterpenoides y/o esteroides Moler la muestra vegetal seca. Agregar un volumen suficiente de cloroformo o diclorometano y extraer por agitación. Filtrar. Si el filtrado es turbio contiene humedad, secarlo agregando sulfato de sodio anhidro y filtrar. En un tubo de ensayo limpio y completamente seco, colocar 1 ml de filtrado orgánico. Añadir 1 ml de anhídrido acético. Por la pared del tubo y con mucha precaución, dejar resbalar 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La formación de colores azules, violetas, rojos o verdes es prueba positiva de que la muestra contiene Esteroides y/o Triterpenoides. 7) Ensayo para Quinonas Ensayo con una fracción : Colocar en un tubo de ensayo unos 5 ml de filtrado acuoso. Añadir 1 ml de peróxido de hidrógeno al 20% y 1 ml de ácido sulfúrico al 50%. Calentar la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Enfriar. Añadir 5 ml de tolueno. Agitar sin emulsionar. Recuperar la fase toluénica. Trasvasar 2 ml fase toluénica a un tubo de ensayo. Añadirle 1 ml de una solución de NaOH al 5% con amoniaco al 2%. Agitar sin emulsionar. Si la capa acuosa toma una coloración rosada a roja intensa es prueba positiva de la presencia de quinonas en la mues tra.

Ensayo directo: Colocar 5 g de muestra fresca (ó 1 g de muestra seca y molida), en un sistema de reflujo, agregar 25 ml de HCl 5%. Reflujar 5 minutos. Dejar enfriar y filtrar. Con el filtrado acuoso proceder como se describe para el ensayo con una fracción acuosa. 8. Reconocimiento de Antocianinas En un erlenmeyer colocar unos 100 g. de muestra fresca finamente desmenuzada. Añadir unos 200 ml de agua. Calentar a ebullición durante unos 5 minutos. Filtrar.

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Ensayo En un tubo de ensayo colocar 2 ml de f iltrado. Añadir 1 ml de NaOH diluido. Observar el color formado. En otro tubo de ensayo colocar otros 2 ml de filtrado. Añadir unas 6 gotas de un ácido mineral diluido. Observar el color formado. Las antocianinas se reconocen por producir diferentes color es a diferentes pH. 9. Reconociemiento de Cumarinas. En un tubo de ensayo grande colocar 1 g de material vegetal fresco y macerado y agregar cantidad suficiente de etanol comercial que cubra el material vegetal. Cubrir la boca del tubo de ensayo con un pa pel filtro blanco y sujetarlo con unas pinzas para tubo de ensayo o con una banda elástica. Agregarle unas gotas de NaOH diluido en el papel filtro que cubre la boca del tubo de ensayo. Calentar hasta ebullición el tubo de ensayo por 5 minutos, enfriar y r etirar el papel filtro. Observar bajo luz ultravioleta a 365 nm la aparición de una coloración fluorescente que puede ser: verde, amarilla, roja en el papel filtro. Nota: El papel filtro normalmente se observa azul fluorescente bajo la luz ultravioleta de 365 nm.

Plantas con alcaloides:

Datura sp. (borrachero), hojas y flores. Catharantus roseus (cortejo), hojas. Hojas de tabaco, té. Plantas con flavonoides: Pétalos de rosas rojas y amarillas. Pétalos de lirio africano. Plantas con saponin as: Hojas de Agave sp.(penca sábila). Fruto de Solanum quitoense (lulo). Cáscara de Dioscorea ssp. (ñame). Plantas con taninos: Hojas de plantago (llantén). Hojas de guayaba Té (Thea sinensis ), hojas. Uvas (Vitis vinifera ). Plátano o guineo (Musa ssp.). Agallas de alepo ( Querquis ssp. ). Corteza de casco de vaca ( Bahuinia picta ). Plantas con esteroides: Semillas de Glicine max (soya). Aceite de oliva (Olea europeae ). Plantas con cardiotónicos: Azuceno de la habana, hoj as. Plantas con antocianinas: Repollo morado.

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Plantas con quinonas:

Hojas de guardaparque. Moras. Uvas sin hollejo. Ruibarbo (rizomas)

6. Reactivos y materiales necesarios por grupo 150 ml HCl al 5% 1 ml peróxido de hidrógeno al 20% 50 ml Acetato de plomo al 4% con ácido acético al 0.5% 2 ml Urea 10M gotas de FeCl 3 al 10% 2 ml de ácido sulfúrico al 50% 2 ml de solución NaOH al 5% con amoniaco al 2% R. Dragendorff, Valser, Mayer y Reineckato de amonio. R. gelatina-sal R. Kedde solucione s A y B 200 ml etanol 50 ml diclorometano 5 ml benceno 2 ml anhídrido acético Acido sulfúrico concentrado Acido clorhídrico concentrado 5 papeles de filtro limaduras de magnesio sulfato de sodio anhidro centrifuga 2000 RPM y 2 -4 tubos cuchillo.

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