Uso y Cuidado del Espectrofotómetro PDF

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Informe de Quimica Analitica Instrumental...

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

E.A.P

FARMACIA Y BIOQUÍMICA PRÁCTICA N°:

1

TEMA: Uso y cuidado del espectrofotómetro de absorción UV-Visible y obtención de espectros.

DOCENTE: Mg. Norma Angélica Carlos Casas AÑO:

2017

Objetivos:   

Operar correctamente el espectrofotómetro de absorción Uv-visible Modelo Genesys 10S UV-VIS marca THERMO SCIENTIFIC. Adquirir experiencia en la obtención de espectros de absorción Demostrar la interacción de la energía radiante y la materia a través de los espectros de absorción.

Fundamento de la espectrofotometría UV-VIS1.

La radiación ultravioleta (UV) y visible comprende sólo una pequeña parte del espectro electromagnético, que incluye otras formas de radiación como radio, infrarrojo (IR), cósmica y rayos X. Cuando la radiación interacciona con la materia, pueden ocurrir varios procesos como reflexión, dispersión, absorbancia , fluorescencia/fosforescencia (absorción y reemisión) y una reacción fotoquímica (absorbancia y rotura de enlaces). En general, cuando se miden espectros UV-visible, sólo es deseable que ocurra absorbancia. Como la luz es una forma de energía, la absorción de la luz por la materia causa que aumente el contenido de energía de las moléculas (o átomos). La energía potencial total de E = hν ν = c ⁄ λ 4 Principios y aplicaciones de espectroscopía UV-visible una molécula, generalmente se representa como la suma de sus energías electrónica, vibracional y rotacional:

La cantidad de energía que una molécula posee en cada forma no es un continuo, sino una serie de niveles o estados discretos. La diferencias de energía entre los diferentes estados siguen el orden:

En algunas moléculas y átomos, los fotones de luz UV y visible tienen suficiente energía para causar transiciones entre los diferentes niveles. La longitud de onda de la luz absorbida es aquella que tiene la energía requerida para mover un electrón desde un nivel

de energía inferior a uno superior. La Figura 1 muestra un ejemplo de transiciones electrónicas en el formaldehído y las longitudes de onda de la luz que las causan.

Figura 1. Estas transiciones deben resultar en bandas de absorbancia muy estrechas, a longitudes de onda características de la diferencia entre los niveles de energía de las especies absorbentes. Esto es cierto para los átomos, como se muestra en la Figura 2.

Figura 2.

Sin embargo en las moléculas, los niveles de energía vibracional y rotacional están superpuestos sobre los niveles de energía electrónica. Como pueden ocurrir muchas transiciones con diferentes energías, las bandas se ensanchan (Figura 3). El ensanchamiento es incluso mayor en las disoluciones, debido a las interacciones disolvente-soluto.

Figura 3.

Diagrama instructivo de “MANEJO DEL ESPECTOFOTROMETRO” Encender el espectrofotómetro antes de realizar la prueba por el fabricante teniendo en cuenta el tiempo de termostatización recomendada

Seleccionar la longitud de onda

SI tiene un fotocolorímetro seleccione el filtro más próximo a la longitud de onda indicada.

Elegir una cubeta para la prueba en blanco (solvente de la muestra) y usar la misma cuba de agua destilada para volver a llenarlo con una porción ahora de la muestra para llenarlo con la muestra solo hasta hasta las 2/3 partes de la cuba. La cubas deben

Tener la precaución de empezar siempre con la muestra más diluida y traslucida (previamente filtrada)

Seleccionar una cuba el cual debe presentarse e en buen estado, limpias y secas

Al limpiar la cubeta nunca tocar la parte lisa, enjuagar con agua destilada y secar con papel tisú.

Llevar a cero la absorbancia en la maquina con agua destilada en la cuba contenida

Cuestionario1,2,3 1. ¿Cuáles son los parámetros que definen a las radiaciones electromagnéticas? La radiación electromagnética puede considerarse una combinación de campos eléctricos y magnéticos alternos que viajan por el espacio con un movimiento de onda. Como la radiación actúa como una onda, puede clasificarse según la longitud de ésta o la frecuencia, relacionadas por :

donde ν es la frecuencia (en segundos), c es la velocidad de la luz (3 × 108 ms-1) y λ es la longitud de onda (en metros). En espectroscopía UV-visible, la longitud de onda normalmente se expresa en nanometros (1 nm = 10-9 m). De las ecuaciones anteriores se deduce que radiación con longitud de onda más corta tiene mayor energía. En espectroscopía UV-visible, la luz UV de longitud de onda más pequeña tiene la energía más alta. En algunos casos, esta energía es suficiente para causar reacciones fotoquímicas no deseadas al medir los espectros (recuerde, es el componente UV de la luz el que causa las quemaduras solares). 2. ¿Cuáles son los valores de número de onda y de frecuencia de una radiación de 425 nm? Numero de onda : γ =

1 λ

1 =2.22 x10-3nm-1 450 nm C 3 x 108 ms−1 Frecuencia: γ = = =6.66 x 10−11 s−1 λ 450 nm γ=

3. Determine la energia asociada a las siguientes radiaciones : 250nm, 500nm, 900 nm e indique la zona del espectro electromagnético que les corresponde. E = hγ



h: 6.62 × 10-34 Js

Para 250nm:

E=6.62×10−34 x

3 x 108 =2.25 x 10−23 J . s pertenece a la región ultravioleta. 250 nm

Para 500 nm :

E=6.62×10−34 x

3 x 108 =3.97 x 10−19 J.s Pertenece a la región Visible Ultravioleta. 500 nm

Para 900nm:

E=6.62×10−34 x

3 x 108 =2.02 x 10−19 J . s 900 nm

Pertenece a la región del Infrarrojo.

Instrumentos de doble haz

Instrumentos de un solo haz

 En los instrumentos de doble haz la luz  Son aquellos en los cuales el haz de luz sigue una única trayectoria entre la fuente y el detector.  La banda de luz atraviesa la muestra que se halla contenida en una celda, la luz transmitida por la muestra pasa al detector originándose una corriente

proveniente de la fuente es dividida en dos

haces después

de

salir

del

monocromador mediante un sistema de espejos divisores. Esta división produce dos haces de luz, uno de ellos se dirige a la celda de referencia, que contiene el blanco, y el otro haz se

eléctrica que por medio de diferentes

dirige hacia la celda de muestra. Los dos haces de luz después de atravesar

circuitos permite observar una señal, ya sea el movimiento de una aguja o

la celda de referencia y la de muestra

señal digital o un registro gráfico.

llegan a detectores separados para obtener la señal correspondiente.  Los sistemas de doble haz tienen la ventaja de que cualquier variación en la intensidad de la fuente, la eficiencia de la red, la reflectividad de los espejos,

la

fotosensibilidad

del

detector, etc., afecta simultáneamente a los dos haces. En consecuencia, la relación de energía de los dos haces permanece siempre constante. 4. Explique las diferencias entre los instrumentos de un solo haz y de doble haz para las mediciones de absorbancia.

5. Defina cada termino : exactitud fotométrica, Ruido, Ancho de banda, Sistema dispersor.  EXACTITUD FOTOMETRICA: es el grado de concordancia entre la absorbancia real y la absorbancia medida.  RUIDO: Describe las desviaciones aleatorias observadas, cuando se repiten mediciones de señales que se controlan de forma continua. Las fuentes de estas desviaciones son errores aleatorios.

 ANCHO DE BANDA: Es el rango de longitudes de onda que un monocromador puede aislar entre dos puntos de un campo espectral, en el cual la Transmitancia equivale a la mitad de la Transmitancia máxima.  SISTEMA DISPERSOR: Pueden ser prismas o redes de difracción. La dispersión de la radiación que los atraviesa se debe a la refracción y ofrecen una buena separación entre las λ dispersadas; sin embargo, tienen el inconveniente de que desvían más las radiaciones de λ más corta y por tanto la dispersión no es línea.

6. ¿Qué es el error absoluto de un espectrofotómetro? ¿Cuál es su valor Numerico? El error es la diferencia entre la medida aparente obtenida y la medida real. Se distingue entre el error absoluto, que es la diferencia propiamente dicha, y el error relativo, que es el cociente entre el error absoluto y la medida.

El error absoluto en un espectrofotómetro es también llamado error propio del instrumento en la medida de la transmitancia (ΔT). Hallado de la diferencia entre el valor medido y el valor verdadero con respecto al signo. Error absoluto: (Valor medido – Valor esperado) x 100 7. ¿Cómo se califica el buen estado de la fuente luminosa de un espectrofotómetro? Para que presente un buen estado debe cumplir ciertas condiciones como estabilidad, direccionalidad, distribución de energía espectral continua y larga vida. La luz de radiación debe tener la potencia suficiente para provocar una luz incidente de suficiente intensidad para la medición. La lámpara o lámparas vienen montadas de fábrica en una base que permite asegurar una determinada posición, para que se mantengan las condiciones de ajuste óptico y enfoque cuando está en operación o se requiere reemplazarla. 8. ¿Cómo se hace la limpieza de las cubetas de muestras luego de ser usadas con una solución coloreada y grasa? Para realizar la limpieza de las cubetas se recomienda usar agua destilada, si en el caso no fuese suficiente este método se debería utilizar una solución limpiadora correspondiente; según AUXILAB, empresa española dedicada a la comercialización de material de laboratorio, se debe limpiar las cubetas colocándolos en un baño termostático con la solución limpiadora. Luego de la limpieza las cubetas tienen que ser aclaradas con

agua precavidamente en varios enjuagues aquí se utiliza agua desmineralizada para el secado de las cubetas se deben emplear una unidad de secado de aire limpio.

Parte experimental: Materiales y Equipos:     

Celdas de plástico Espectrofotómetro Marca Genesys 10S UV-Vis Fuente de lámpara de Wolframio sistema óptico de doble haz Pipetas 1 ml ,5 ml y 10 ml Fiolas de 5 ml, 10 ml, 100 ml, 250 ml Estándar de azosulfamida 5%

Obtención del espectro del estándar de azosulfamida 5%:   

Se tomaron 2.5 ml del estándar de azosulfamida 5% a través de una pipeta y se trasvaso a una fiola de 250ml el cual fue enrasada con agua destilada. El objetivo de la dilución fue para obtener una concentración de 500ug/ml el cual puede ser leído sin errores por el espectrofotómetro UV-VIS Genesys 10S Las lecturas se hicieron desde 450nm a 700 nm mediante un barrido.

Figura 5. Espectro de azosulfamida. Grafica % Tramitancia vs Longitud de onda de 450 nm ah 700nm

Discusión : Figura 6. Espectro de azosulfamida 5% la grafica (absorbancia vs Long. de Según los estud d Onda) muestra el pico con la longitud de onda optima que es de 525nm optima es de 52 en con una absorbancia de 0.370 un poco, podem abosrbancia pudieron haber variado por diferentes razones de las cuales hay que recordar bien como son la temperatura, la concentración si es mas diluida o concentrada, el pH la polaridad de nuestro solvente y otros.

Conclusiones: 

Se pudo conocer el funcionamiento y el manejo del espectrómetro UVvisible Genesys 10S marca Thermo Scientific.



Se obtuvo el espectro de azosulfamida al 5%.

Bibliografía:

1. Owen T. Fundamentos de la espectrometría UV-Visible moderna. Alemania: Agilent technologie; 2000. Pp 2- 20.

2. Pickering, W. Química analítica moderna. 1ed. España: Editorial REVERTE; 1980 3. Skogg D, Holler F, Crouch S. Principios de Análisis instrumental. 6ed. México: CengageLearning; 2008.

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS (Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

E.A.P

FARMACIA Y BIOQUÍMICA PRÁCTICA N°:

2

TEMA: Obtención del espectro de azosulfamida, Longitud de onda optima y Curva de Ringbown.

DÍA DE PRÁCTICA: viernes (8 a.m.- 4 p.m.) NOMBRE:  Sánchez de la Cruz, Bryan Guilmar.

DOCENTE: Mg. Norma Angélica Carlos Casas AÑO:

2017

Objetivos: 

Conocer el comportamiento de las sutancias frente a las radiaciones electromagnéticas



Determinar la longitud de onda optima de la azosulfamida 5%



Determinar la zona de trabajo y la concentración optima mediante la curva de Ringbown.

Materiales y Equipos:     

Celdas de plástico Espectrofotómetro Marca Genesys 10S UV-Vis Fuente de lámpara de Wolframio sistema óptico de doble haz Pipetas 1 ml ,5 ml y 10 ml Fiolas de 5 ml, 10 ml, 100 ml, 250 ml Estándar de azosulfamida 5%

Procedimiento experimental :



Se tomo 2.5ml de azosulfamida estandar contenidos en un tubo de ensayo el cual se paso de diluir en una fiola de 250ml obteniendo una concentración de 500 ug/ml de esta solución se comenzaron a preparar las siguiente soluciones que se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Soluciones preparadas a partir de una solución de 500 ug/ml de azosulfamida al 5% concentración en µg/ml 0.1 0 0.6 1 2 4 5 8 10 12 14 15 16 18 20 25 30 35 40 50 60 80 100







%T

Absortancia 96.4 94.7 93.6 86.8 83.2 68.3 66.2 50.1

3.6 5.3 6.4 13.2 16.8 31.7 33.8 49.9 -

40 28.7 31.9 28 25.3 24.7 11.9 9.8 6.4 3.1 2.3 1.2 0.2 0.1

60 71.3 69.1 72 74.7 75.3 88.1 91.2 93.6 96.9 97.7 98.8 99.8 99.9

Luego de preparar estas soluciones cada concentración se llevo al espectrómetro Uv-Vis Genesys 10S marca Thermo, se midieron los valores de tramitancias a un valor de longitud de onda optima de 525 nm, luego se calcularon los valores de absortancia. Con la ayuda de un papel milimetrado se elaboro la curva de ringbown donde se usaron los valores de absortancia en el eje Y y los valores de concentración en el eje X el resultado fue una curva sigmoidea.

Se hallo la zona de trabajo que va desde 3.5ug/ml hasta 39 ug/ml con una concentración optima de 7.2ug/ml.

Cuestionario :

1. De acuerdo a la estructura química del compuesto estudiado ubique el o los grupos cromoforos señale las transiciones electrónicas respectivas.

Grupo : SO2= Presenta transiciones electrónicas pi. Grupo: N=N : presenta transiciones electrónicas pi 2. Calcule la energia y el numero de ondas de la longitud de onda optima obtenida. E = hγ

E=6.62×10−34 x

3 x 108 =3.78 x 10−19 J.s-1 525 nm γ=

γ=

1 λ

1 =1.904 x 10−3 nm−1 525 nm

3. De acuerdo a la curva de Ringbown, explique y fundamente ¿a que se debe la formación de mesetas, inferior y superior?2,3. Para obtener el intervalo óptimo de concentraciones primero se construye la curva de Ringbom, que consiste en construir una gráfica de absorbancia (100- %T) vs. Log Concentración. Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva en forma de S con una meseta superior y una meseta inferior. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y concentración. En esta gráfica, se trazan líneas paralelas en las

mesetas superior e inferior, permitiendo realizar los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte baja y con la parte alta, los cuales pueden servir para determinar un valor para los límites de detección mínimo y máximo, respectivamente. 4. Investigue sobre los principales errores en la lectura de absorbancia relacionados con la concentración. (Error relativo ∆ c / c ), error absoluto ∆T y la curva de Crackford 1. Los errores indeterminados que se producen en la lectura de las escalas de transmitancia o absorbancia son errores instrumentales siempre presentes y deben ser tomados en cuenta por todos los usuarios de espectrofotómetros cuando realizan mediciones cuantitativas. Pequeños errores en la lectura de la transmitancia o de la absorbancia pueden ocasionar errores grandes en la concentración cuando se opera en los extremos de la escala. El error absoluto cometido en la determinación de la concentración, para una cierto error de lectura de transmitancia, es pequeño, pero al ser pequeña la concentración, el error relativo puede ser grande. Esto es, el error absoluto en una concentración es pequeño, ahora bien el error relativo (el error absoluto dividido por la concentración a determinar) será elevado, dando lugar de nuevo a poca precisión en la medida de la concentración, intuitivamente se puede concluir que parece razonable aceptar que los valores intermedios de la transmitancia son los que darán una precisión óptima, esto explica la importancia de la gráfica de la curva de Ringbown. Curva de Crackford: Si: (ΔC/C) / ΔT = 0.4343 / T. logT.

A partir de esta última relación se construye la curva del error o curva de Crawford graficando el valor absoluto de (D C/C) / D T vs. T, tomando transmitancia entre cero y uno. Esta gráfica indica que el error depende en forma compleja de la medida de la transmitancia y para valores muy bajos o muy altos de transmitancia, el error en la concentración crece exponencialmente, mientras que para valores intermedios el error permanece aproximadamente constante, presentándose un mínimo error en la concentración para la transmitancia correspondiente a 0.368 o 36.8 %T.

Discusión de resultados: En esta práctica se realizó tanto el espectro de absorción como el espectro de transmisión de la azosulfamida, obteniendo a partir de ella la longitud de onda óptima, la cual fue de 525nm; esto nos servirá para el trazo de la curva de Ringbown. Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbown corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y concentración, como se vio en los resultados las concentraciones usadas fueron las de la tabla 1. El cual mediante los trazos señalados como dice la teoría se pudo obtener la concetracion minima, optima y máxima, ayuda valiosa para elaborar nuestra curva de calibración que según la ley de Beer debe mostrar un comportamiento lineal si no fuese el caso entonces estaríamos hablando de las desviaciones a esta ley5. Conclusiones: 

La longitud de onda máxima obtenida en las dos concentraciones de azosulfamida fue de 525nm.



Determinando la curva de Ringbown podemos demostrar mediante trazos y rectas en la gráfica, que no todas las concentraciones cumplen con la ley de LambertBeer; es decir, se halla la concentración óptima y la zona de trabajo óptima (concentraciones mínima y máxima).

Bibliografia 1. Olsen E. Métodos ópticos de análisis. Espectrofotometría ultravioleta y visible. Reverte. Barcelona, 1990. Pág. 87-88. 2. Brunatti C, Martín A. Introducción a la Espectroscopía de Absorción Molecular Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano. Medición de Transmitancia y Absorbancia. Pág 2. 3. Olsen E. Métodos ópticos de análisis. Espectrofotometría ultravioleta y visible. Reverte. Barcelona, 1990. Pág. 91. 4. Universidad Nacional de Colombia. Establecimiento de un método espectrofotométrico.URL: http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2001184/lecciones/Cap10/01_01_01. htm 5. Skoog Douglas, Principios de análisis instrumental. 6ta edición. CENGAGE, 2007....