Manejo y Cuidado Del Microscopio PDF

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PRÁCTICA # 2 “MANEJO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO” INTRODUCCIÓN: El microscopio es, sin lugar a dudas, el instrumento más importante en el laboratorio microbiológico. Se usa para aumentar el tamaño de la imagen aparente de los objetos, lo cuál hace posible ver los detalles estructurales de los microorganismos. Sus antecedentes más notables se remontan al s. XVII cuando Anthony Van Leewenhoek (Delft, Holanda, 1632 – 1723), reporta lo siguiente en una de las cartas que dirigió a la “British Royal Society” : “ En el año de 1675, descubrí criaturas vivientes en agua de lluvia que había permoneado sólo unos días en un recipiente… esto me invitó a observar más atentamente el agua, especialmente los pequeños animalejos que me parecían diez mil veces más pequeños que aquellos que pueden percibirse en el agua a simple vista”. Leewenhoek observó, entre otras cosas, bacterias y protozoarios en el agua de la lluvia, en infusiones diversas y en su sarro dental. Sus descripciones son, hasta la fecha excelentes y fácilmente reconocibles. El estudio microscópico de los organismos proporciona datos fundamentales para su identificación, como forma, tamaño, reacción a diferentes colorantes y estructuras celulares; orienta al microbiólogo cuando trata de aislar microorganismos y permite establecer características como pureza, presencia de contaminantes, variedad o edad de una población entre otras cosas. Por ello es tan importante saber utilizar este instrumento y desde luego, cuidarlo adecuadamente. Para ello, en esta practica se incluye la descripción de los componentes de un microscopio compuesto y las funciones de cada uno de ellos; asimismo. Se describen las características de las lentes amplificadoras y las condiciones en las que se puede utilizar cada objetivo, así como los pasos que se deben seguir para establecer una iluminación adecuada, el enfoque correcto y la forma precisa de manejar el microscopio.

OBJETIVOS: Mediante esta practica, el alumno lograra:     

identificar cada una de las partes de el microscopio iluminar correctamente el microscopio óptico de campo claro enfocar adecuadamente el microscopio en todos sus aumentos reportar correctamente las observaciones microscópicas cuidar esmeradamente el microscopio en todo momento, sobre todo, cuando lo utilice.

GENERALIDADES: En la actualidad existen dos tipos de microscopia, según la forma en que se amplifica la imagen:  La microscopia óptica: en esta la imagen se amplifica sucesivamente por una seria de lentes. Este sistema permite obtener aumentos de 100 a 1000 diámetros y en algunos casos, hasta 2000 según el tipo de luz que se utilice y la forma de iluminar el objeto en estudio o preparación. Los microscopios ópticos pueden ser de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases, de fluorescencia y de ultravioleta. El de campo claro es el mas utilizado para el estudio microbiológico en general.  La microscopia electrónica: es aquella en la cual la amplificación de la imagen se obtiene mediante un haz de electrones (que sustituye la luz) y un campo magnético (que hace las veces de lentes) produce imágenes con aumentos de 200000 a 400000 diámetros. MICROSCOPIO ÓPTICO DE CAMPO CLARO: En la microscopia de campo claro, el campo microscópico o área observada esta brillantemente iluminada y los objetos en estudio aparecen más oscuros al fondo. Un microscopio óptico de fondo claro esta integrado por un sistema óptico que permite iluminar el objeto en estudio y amplificar su imagen, y un sistema mecánico que da soporte y movimiento a los componentes ópticos, explicado de manera muy concisa, el fundamento de su funcionamiento es el siguiente: la luz procedente de la lámpara y del condensador atraviesa la preparación (en la cual se encuentra el objeto en estudio) y permite que la primera lente (objetivo) forme una imagen aumentada de lo que hay en ella; antes de ser vista, esta imagen es amplificada nuevamente por otra lente (ocular). A continuación se describen brevemente las funciones de los componentes fundamentales del microscopio:

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 Base, soporte y cuerpo del tubo, sirven para mantener en posición a todos los componentes del microscopio y son gruesos y fuertes, para disminuir la vibración.  Tubo intercambiable del microscopio: Se encuentra insertado en la parte superior del cuerpo del tubo, soporta el ocular y permite alinearlo con el objetivo seleccionado para una observación.  Platina: En ella se coloca la preparación o portaobjetos de estudio, la platina esta equipada con pinzas para sujetar la preparación y dos tornillos 3.1, para desplazarla en sentido vertical y horizontal, lo que facilita la localización del objeto y la revisión de la preparación.  Revólver: Es el disco que soporta a los objetivos y se gira para colocar el objetivo requerido bajo el tubo.  Tornillo micrométrico o de enfoque preciso: Con este se puede desplazar el tubo en forma más lenta, lo que permite hacer los movimientos finos que se requieren para obtener el enfoque exacto y preciso.  Tornillo macrométrico o de enfoque aproximado: Este permite desplazar el tubo del microscopio (o ala platina en algunos modelos) acercando el objetivo a la preparación, lo que permite localizar la imagen y lograr un enfoque aproximado. Sistema óptico: Esta integrado por una fuente luminosa, una lente condensadora de luz que la dirige hacia el espécimen y dos juegos de lentes que ayudan a la amplificación de imagen.  Interruptor  Fuente de luz : Es una lámpara que se encuentra colocada debajo de el objeto y emite la luz que pasa por el condensador, para después iluminar la preparación, para regular la intensidad de la luz algunos microscopios tienen integrado a la lámpara, un diafragma, el que se abre o se cierra, en otros únicamente regula el voltaje.  Diafragma de campo  Condensador: Esta interpuesto entre la fuente de luz y la muestra, el condensador recibe la luz de la lámpara, rectifica los rayos de luz y los concentra o enfoca en un cono de luz sobre el campo donde se sitúa la muestra, de tal manera que los rayos después de atravesar la preparación, penetra a la lente de el objetivo con el mejor ángulo posible, para ello el condensador se baja o se sube hasta alcanzar una posición que origine un foco preciso.  Diafragma Iris: Controla el diámetro del circulo de luz que sale de el sistema condensador, al mover la palanca del diafragma iris, es posible controlar la cantidad de luz que entra al condensador y regular el paso de la luz para dar nitidez a la imagen, el propósito de el diafragma no es controlar la intensidad de la luz que llega al objeto, sino asegurar que la que sale del condensador llene exactamente la lente de el objetivo, si el diafragma es demasiado grande, parte de la luz pasara alrededor del objeto y originara brillo reduciendo la claridad de la imagen.  Objetivos: Son las lentes que amplifican la imagen del campo del microscopio y por lo tanto, del objeto en estudio, la mayoría de los microscopios tiene tres objetivos que proporcionan diferentes aumentos, siendo los mas comunes el 10x, 40x, 90x y 100x , la lente de bajo poder de aumento abarca un campo microscópico con una superficie mayor, se utiliza para localizar los objetos de interés y para seleccionar al espécimen a observar, la lente de 40x permite la visualización detallada de microorganismos grandes, como algas, protozoarios y hongos, la lente de 90x 0 100x ( que se emplea con aceite de inmersión ) se utiliza para observar bacterias o microorganismos eucariontes pequeños. Cuando el microscopio es par focal, las distintas lentes están ajustadas de tal manera que, al enfocar el espécimen con una lente, así permanece al cambiar a otros objetivos, de esta manera se puede enfocar con el objetivo de poco aumento y cambiar a los objetivos de mayos aumento sin volver a enfocar o realizando ajustes menores.  Ocular: Esta lente amplifica aun más la imagen procedente del objetivo y permite que el ojo la perciba, el ocular se encuentra insertado en el tubo intercambiable. La función de los sistemas de lentes amplificadoras interpuestas entre la muestra y el ojo (objetivo y ocular) consiste, en gran parte, en aumentar el ángulo aparente que forman con el ojo los objetos que estas dentro del campo microscópico. Para hacer una buena observación es muy importante que la imagen aumentada no se encuentre distorsionada, de manera que retenga los detalles esenciales del espécimen, en la microcopia óptica, especialmente en la de pequeño aumento existen varios tipos de distorsiones que resultan de las propiedades de las lentes por lo que, en los microscopios modernos, cada sistema de lentes (condensador objetivo y ocular) consiste en un juego de varias lentes de diversas formas y dimensiones, cuyo diseño permite corregir las distintas distorsiones, de este modo la amplificación y la calidad de la imagen quedan determinadas por :  las características y calidad de las lentes  la longitud de onda de luz empleada  el medio que atraviesa la luz antes de llegar al objetivo (aire, agua, aceité de inmersión). Estas a su vez determinan la capacidad amplificadora y el poder de resolución del microscopio. En el ocular se indica su coeficiente de aumento individual, por ejemplo 10x, que significa que su poder de aumento es 10 veces o 10 diámetros.

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En el objetivo hay cuatro datos: 40 X = Coeficiente de aumento 0.65 = Apertura numérico 160 = (Mm.) la longitud mecánica del tubo (medida desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular) 0.17 = Requiere cubre ojos de 0.17mm. de espesor (cubreobjetos num. 1) En lugar de 0.l7 puede estar marcado: //0 /0.11

= Acepta cubreobjetos desde 0.17 (num. 1) a 0.22 (num. 2) de espesor = No requiere cubreobjetos = 0.27 (Korr) es ajustable a los diferentes espesores de los cubreobjetos (desde 0.11 hasta 0.27 mm. ).

Características del ocular y los objetivos: Los coeficientes de aumento de los oculares y de los objetivos, permiten calcular el aumento total o capacidad amplificadora de un microscopio, que es igual a: producto de los coeficientes de aumento del ocular y del objetivo que se utilizan; por ejemplo: en un microscopio con un ocular de 6x y objetivos de 10x y 40x y 100x, la imagen se amplifica 60, 240 y 600 veces respectivamente. Mediante la utilización de oculares con mayores coeficientes de aumento, es posible obtener mayores amplificaciones de la imagen, aunque esta tiene un límite al que se conoce como aumento útil de un microscopio. El aumento útil del microscopio esta dado por las propiedades físicas de la luz (que establecen el limite fijo de la amplificación efectiva) y una característica del sistema de lentes, conocida como apertura numérica, las que en conjunto dan lugar a una propiedad conocida como poder de resolución. Apoca resolución, las estructuras se ven juntas, entre mayor es la resolución, mayor es el detalle con que se observan. Resolución de dos puntos: El poder o límite de resolución de una lente, corresponde a su capacidad para presentar distintos y separados dos puntos adyacentes, determinando la máxima amplificación útil que se puede obtener con un microscopio óptico. El poder de resolución (δ) se expresa mediante la siguiente ecuación: δ = longitud de onda / Apertura numérica De acuerdo con la teoría óptica, la resolución mas alta posible en un microscopio de luz compuesto permitirá ver con claridad objetos cuyo diámetro sea de casi 0.2 mm. Lo anterior significa el poder de resolución es igual al diámetro de la estructura visible mas pequeña, de este modo en un microscopio óptico compuesto los objetos de dimensiones menores alas señaladas, al ser amplificados, darán lugar a imágenes difusas. La amplificación que aumenta el tamaño, pero no su detalle, se denomina amplificación o aumento vacío. Efecto de la longitud de onda sobre el poder de resolución, cuanto mas corta sea la longitud de onda empleada, mas pequeña será la estructura visible (mayor poder de resolución), en este sentido, la luz aportara mayor poder de resolución que la luz roja, sin embargo puesto que el espectro de luz visible es relativamente estrecho el aumento de la resolución disminuyendo la longitud de onda de la luz empleada, tiene un valor limitado. El mayor aumento de la resolución de un microscopio se consigue aumentado la apertura numérica La apertura numérica de la lente es función del diámetro real del objetivo en relación con su distancia focal, lo que determina el Angulo (u) de los rayos de luz más oblicuos que pueden entrar al objetivo y el poder de desviar el rayo luminoso, índice de refracción (N) del medio que hay entre la muestra y el objetivo. Existe correspondencia entre la amplificación del objetivo y su apertura numérica, las lentes con mayor coeficiente de aumento, por lo general, tienen mayor apertura numérica, pero como se indica en la formula el medio por el que pasa la luz también influye en la apertura numérica; de este modo, cuando el objetivo esta separado del objeto por aire, su apertura nunca puede ser mayor de 1.0 debido a que el índice de refracción del aire es menor que el de el vidrio, los rayos luminosos se refractan o desvían cuando pasan por el portaobjetos al aire, por lo que se pierde la mayor parte de los rayos luminosos, para alcanzar valores mayores el objetivo debe estar inmerso en un medio con un índice de refracción mayor que el del aire y similar al del vidrio, de esta manera se disminuye la desviación y un porcentaje mayor de rayos luminosos procedentes de la muestra pasan directamente al objetivo, proporcionando una mayor resolución y una imagen mas clara. El aceite de inmersión aumenta la cantidad de luz que pasa a la lente del objetivo La apertura numérica (AN) permite calcular los límites de aumento útil multiplicándola por 500 y por 1000. Ej. Si el objetivo tiene una apertura numérica de 0.65 por lo que pueden usarse aumentos totales de 325 a 650 diámetros, fuera de esos limites se obtienen “aumentos vacíos “en forma comparable a lo que suceda cuando

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se observan un mosaico tan lejos que solo se ven colores pero no figuras delimitadas, o tan cerca que se ve cada piedrecilla pero se pierde el conjunto Otros factores relacionados con el sistema de la lente utilizada son la profundidad de campo y el área de campo, la primera es el espesor del espécimen en foco de cualquier momento y es mayor con menor poder de aumento, con la inmersión en aceite, la profundidad de campo es muy superficial, por lo común menor de 1mm, el área de campo es mayor con el menor aumento y es por esta razón que las lentes de bajo coeficiente de aumentos son útiles para localizar objetos. Datos ópticos sobre las lentes objetivos de uso común: Hay que insistir en que el sistema de iluminación es de suma importancia, en especial cuando se emplean objetivos de alto poder de amplificación, la cantidad de luz que entra en el sistema debe enfocarse en el espécimen y para este propósito, se usa el sistema de lentes del condensador y el diafragmas, el primero permite obtener un foco preciso en tanto que, el segundo, controla el circulo de luz que sale de el condensador. Relación entre la distancia de trabajo de las lentes y el ajuste del diafragma Iris: Cuanto mas corta es la distancia de trabajo, más abierto esta el diafragma. MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASES: Aun cuando los objetos biológicos no absorben diferencialmente la luz visible, sus distancias estructurales tienen correlación en forma inversa con la velocidad de propagación de luz, cuando mayor sea el índice de refracción, menos será dicha velocidad, esta propiedad, aplica en la microscopia de contraste de fases, permitiendo hacer visibles estructuras que de otra manera no lo serian o resultarían poco visibles. Suponiendo un haz de luz que incide sobre dos estructuras transparentes A y B las cuales poseen índices de refracción (N) distintos y espesores iguales NA y NB , la onda que atraviesa la capa B se retrasa en relación con la que atraviesa la capa A , el ojo no percibe este retraso y los dos medios parecen igualmente transparentes. En el microscopio de contrastes de fases, se introducen elementos ópticos para aprovechar la diferencia de retardos, que esta dada por las diferencias en los índices de refracción del objeto. Para ello se separa la radiación dirección directa difractada, y se produce en esta ultima, un retraso de fase respecto a la primera para formar una imagen con la suma de los dos. Los pequeños cambios de fase que se producen en el objeto se amplían y se producen en cambios de intensidad de la imagen viéndose en estas partes más o menos oscuras. La microscopia de fase se usa como un método de rutina en la observación de células vivas. En la práctica, el contraste de fase (PH) se integra de la siguiente forma: dentro del condensador se monta un diafragma anular (PH) cuya imagen se forma en el plano focal del objetivo, donde se encuentra otro PH (este diafragma es otro filtro neutro en forma de anillo). La radiación difractada procedente del objeto atraviesa el anillo PH en la zona semitransparente, en donde se produce un retrazo de aproximadamente ¼ de longitud de onda. Los elementos ópticos para el contraste de fases son los siguientes: A.- Condensador especial PH o condensador revolver con PH B.- Objetivo 10/0.25 PH 1 Con anillo de fase 1 Objetivo 40/0.65 PH 2 con anillo de fase 2 Objetivo 100/1.25 oil PH 3 con anillo de fase 3 C.- Ocular auxiliar Ajuste del microscopio para el contraste de fases 1) Iniciar la técnica de iluminación según Kohler en la posición J del condensador revolver (campo claro) 2) Ajustar el condensador revolver en la posición PH correspondiente al objetivo PH (PH 1 con 1, PH 2 con 2 etc.) 3) Sustituir el ocular normal por el auxiliar y hacer el enfoque de los dos anillos de fases (negro el del objetivo y blanco el del condensador) 4) Con la ayuda de los botones de ajuste situado en el condensador, hacer coincidir el anillo de fases blanco con el negro. 5) Retirar el ocular auxiliar y colocar nuevamente el ocular normal, insertar un filtro verde para aumentar el contraste de los grises. 6) Al cambiar el objetivo, solo adaptar el diafragma de campo luminoso al tamaño del campo visual y cambiar la posición del condensador al que corresponde, según el nuevo objetivo, ejemplo PH 2 con 2 y PH 3 con 3.

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MICROSCOPIA DE CAMPO OSCURO La microscopia del campo oscuro se consigue situando una pantalla circular opaca en la entrada del condensador de ABBE, de manera que se oscurezca la parte central, o bien, empleando tipos especiales de condensadores (paraboide o cardioide), la preparación se ilumina con un haz de luz suficientemente fino, bajo un ángulo agudo, de forma que no incida en la lente frontal del objetivo. ej. Se muestra como el haz de luz ilumina oblicuamente al espécimen y alcance el objetivo, el campo aparecerá uniformemente oscuro y cada partícula se vera como un punto luminoso por efecto de difusión de la luz que incide sobre ella. Dirección del haz de luz en un microscopio de fondo oscuro La apertura numérica del objetivo debe ser suficientemente baja para excluir la luz directa del condensador, para el trabajo con aceite de inmersión, se usa un objetivo con un diafragma de iris incorporado, por medio de la cual la apertura numérica puede reducirse. Esta técnica se emplea para observar preparaciones biológicas sin colorear y entre otras cosas, permite observar el movimiento browniano y los flagelos, así como estudiar células en acción y los movimientos implicados en procesos tales como la mitosis y la migración celular. Elementos ópticos para campo oscuro: 1.- Posición D de condensador revolver 1.4 AN, o ultra condensador 1.2/1.4 AN oil Además existen condensadores para campo oscuro sin aceite con los que se obtienen aumentos menores. AN 0.8/0.9 para objetivos con apertura numérica de 0.6- 0.7, y condensadores 0.7/0.85 para objetivos con AN de 0.4-0.6 2.- Objetivos con diafragma de iris 100/1.25 oil iris 40/1.0 oil iris 3.- Sin filtro 4.- Doble inmersión de aceite (sobre la preparación y el condensador), solamente en condensadores con 1.4 AN o 1.2/1.4 AN MICROSCOPIA DE FLUORESENCIA La fluorescencia la propiedad que tienen algunas sustancias para emitir luz después de haber sido expuestas a una radiación del longitud de onda corta a la que se denomina radiación exci...