UT.4. La microscopía - Definición, tipos de microscopio, funcionamiento, características que definen PDF

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Definición, tipos de microscopio, funcionamiento, características que definen al microscopio, microscopio óptico, normas de uso, otros microscopios...

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La microscopía

Violeta Vargas García

La microscopía Unidad tema 4 Violeta Vargas García

ÍNDICE 1.El microscopio

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1.1. Definición

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1.2. Tipos de microscopio

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 Según la radiación

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 Según el nº de lentes

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 Según la transmisión de luz

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 Según el nº de oculares

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 Según la configuración de los elementos

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1.3. Funcionamiento

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1.4. Características que definen al microscopio

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 Aumento

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Profundidad de foco o poder penetrante

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Poder separador e iluminación

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2. El microscopio óptico

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2.1. Introducción

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2.2. Partes del microscopio óptico

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Sistema mecánico

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Sistema óptico

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3. Normas de uso

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3.1 Manejo de los objetivos

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3.2. El objetivo de inmersión

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3.3. Mantenimiento 4. Otros microscopios

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4.1. Microscopio electrónico

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4.2. Microscopio de campo oscuro

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4.3. Microscopio de contraste de fases

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4.4. Microscopio de fluorescencia

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4.5. Microscopio de campo iónico (FIM)

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4.6. Microscopio de rayos X

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5. Webgrafía

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1. El microscopio 1.1. Definición Etimológicamente micro significa pequeño, y scopein, mirar. Instrumento que permite observar lo que es invisible a simple vista, es decir, teniendo en cuenta el poder de resolución del ojo humano en óptimas condiciones, el cual es de 0,23mm = 230 micrones, todo elemento menor a esa cifra sólo será perceptible mediante el uso del microscopio. Este aparato consta de una o varias lentes de aumento y funciona por refracción.

1.2. Tipos de microscopio Según la radiación 1. Microscopio óptico Utiliza un haz de luz visible directamente apuntando a la muestra, esta se conduce a través del objetivo y del ocular hasta formar la imagen en el ojo del observador. Este es el tipo de microscopio más habitual pero su resolución está limitada por la difracción de la luz. El aumento máximo que se puede obtener con este tipo de microscopio alcanza alrededor de 1500x. 2. Microscopio electrónico Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz para generar la imagen de la muestra. Esto requiere encerrar la muestra en una pequeña cámara donde se produce el vacío para permitir hacer un barrido de la muestra con electrones. Algunos de estos electrones son reflejados o remitidos por la muestra e impactan en una pantalla que a continuación permite reconstruir la imagen de la muestra. 3. Microscopio de luz ultravioleta Ilumina la muestra con una radiación con longitud de onda más corta que la luz visible, es decir, con luz ultravioleta. Se alcanza una mejor resolución que con luz visible. Además, el contraste obtenido en la muestra es distinto que en los microscopios ópticos. De este modo, con el microscopio de luz ultravioleta pueden observar muestras que aparecen transparentes si son observadas con luz visible. 4. Microscopio de luz polarizada También conocido como microscopio petrográfico. Este microscopio es en realidad un tipo de microscopio óptico al que se la han añadido dos polarizadores. Esto significa que la onda de luz utilizada para observar la muestra tiene una dirección de oscilación concreta. Este tipo de microscopio es muy útil para observar estructuras cristalinas de rocas y minerales.

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La microscopía Unidad tema 4 Violeta Vargas García 5. Microscopio de fluorescencia Utilizan las propiedades de fluorescencia para generar una imagen de la muestra. Este microscopio permite observar sustancias que emiten luz propia cuando son iluminadas con una longitud de onda determinada. Para ello la muestra es habitualmente iluminada con una lámpara xenón o con una lámpara de vapor de mercurio. Estos microscopios incorporan además filtros de luz para aislar la luz correspondiente a la muestra.

Según el nº de lentes 1. Microscopio simple Instrumento que dispone de una única lente y es más habitualmente conocido como lupa. Aún así, con un microscopio simple pueden conseguirse grandes aumentos. 2. Microscopio compuesto Instrumento que dispone de por lo menos dos lentes. Este es el caso más habitual en todos los microscopios modernos. Normalmente los microscopios disponen de distintas lentes tanto en el objetivo como en el ocular para corregir las aberraciones ópticas y alcanzar una imagen con buena calidad. La invención del microscopio está asociada con la invención del microscopio compuesto.

Simple

Compuesto 

Según la transmisión de luz 1. Microscopio de luz transmitida En este tipo de microscopio la luz atraviesa la muestra. Para esta clase de microscopios es necesario preparar la muestra cortándola en láminas muy finas. La muestra se ilumina desde debajo la platina. La preparación de la muestra hace que esta sea semitransparente y parte de la luz pueda atravesarla y llegar al objetivo para ser observada posteriormente a través del ocular. En general este es el sistema de iluminación más utilizado entre los microscopios ópticos. Se usan con frecuencia en hidrogeología, hidrobiología y en medicina.

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La microscopía Unidad tema 4 Violeta Vargas García 2. Microscopio de luz reflejada En este caso la luz ilumina la muestra y parte de esta es reflejada y dirigida al objetivo. De este modo es necesario iluminar la muestra desde la parte superior de la platina. Este tipo de microscopía es utilizada para examinar materiales opacos como pueden ser estructuras metálicas, materiales cerámicos, etc. Existen microscopios ópticos que permiten los dos tipos de iluminación de modo que es posible observar tanto muestras semitransparentes como opacas. Estos se usan con frecuencia en la microscopía de fluorescencia o de mineralogía.

Según el nº de oculares 1. Microscopio monocular Este tipo de microscopio dispone de un solo ocular a través del cual se puede observar la muestra. Su desventaja principal es que puede resultar un poco incómodo si tiene que utilizarse durante largos periodos de tiempo. Por este motivo los microscopios monoculares no son en general utilizados en ámbitos profesionales. 2. Microscopio binocular Estos microscopios constan de dos oculares, esto permite observar la muestra simultáneamente con los dos ojos resultando más cómodos para el usuario. Este es el tipo de microscopio más utilizado en los laboratorios de investigación. La distancia entre los dos oculares puede regularse para adaptarse a las necesidades del usuario. 3. Microscopio trinocular Este tipo de microscopios está equipado con dos oculares para observar la muestra además de un tercer ocular para conectar una cámara. En el caso de conectar una cámara digital esta puede conectarse a un ordenador para ver las imágenes de la muestra en tiempo real. Con este microscopio es posible observar la muestra y al mismo tiempo tomar fotografías o videos con la cámara.

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Según la configuración de los elementos 1. Microscopio vertical En esta configuración el foco de luz se encuentra en la parte inferior de la estructura, encima se encuentra la platina dónde se coloca la muestra y finalmente el cabezal con los objetivos y el ocular. 2. Microscopio invertido Esto microscopios tienen una configuración totalmente opuesta a la del microscopio vertical. La muestra es iluminada desde la parte superior y los elementos ópticos se encuentran debajo la platina. Con este tipo de microscopio es posible observar muestras colocadas en el fondo de un recipiente. Esto es muy útil para mantenerlas hidratadas y poder así observar muestras vivas y procesos biológicos que duran días.

1.3. Funcionamiento › › ›

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El funcionamiento del microscopio se basa en un sistema de lentes, el microscopio combina al menos dos juegos de lentes, el objetivo y el ocular. Por detrás de la muestra hay una lámpara cuya luz atraviesa la muestra y forma una imagen en el objetivo que es ampliada y proyectada hacia el ocular. La imagen que proyecta el objetivo se forma en el aire entre el objetivo y el ocular. Esta imagen se conoce como imagen primaria o imagen aérea. Esta imagen primaria alcanza el siguiente juego de lentes, el ocular, que actúa como una lupa ampliando la imagen primaria. La imagen ampliada por el ocular, llamada imagen secundaria, alcanza finalmente la retina y es la que ve el observador. Esta imagen se suele conocer con el nombre de “imagen virtual” ya que es percibida por el observador como si estuviese situada en un plano más allá del objeto real observado. Los rayos de luz que percibe el ojo y que forman la imagen final parecen provenir de este plano pero realmente el objeto no está ahí. La distancia entre el punto focal imagen del objetivo, y el punto focal objeto del ocular se llama longitud de tubo, y esta viene definida por un valor fijo en los microscopios: 16cm.

1.4. Características que definen al microscopio Este instrumento está formado por dos lentes convergentes: › Lente objetivo: situada muy cerca del objeto. › Lente ocular: al otro extremo del tubo, está situada cerca del ojo y hace la función de lupa sobre la lente objetivo.

 Aumento El aumento del microscopio viene dado por el poder amplificador, el cual es el producto de la amplificación lateral del objetivo por la amplificación angular del ocular. El aumento del objetivo se calcula dividiendo 16 entre la distancia focal en cm. Cuanto mayor es el aumento del objetivo más cerca está del objeto y menor es la lente, por lo que llega menos luz al ojo. Por tanto, a mayor aumento menos luminosidad.

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 Profundidad de foco o poder penetrante Poder de resolución del microscopio en el plano vertical. El poder penetrante expresa la cualidad que posee un objetivo para poder representar perfectamente detallados los diversos planos de una preparación sin variar la posición de enfoque. A mayor profundidad de foco, menor poder de separación

 Poder separador e iluminación Poder de resolución del microscopio en el plano horizontal. El poder separador se ve limitado por la longitud de onda que se use, la luz visible con la que funcionan los microscopios ópticos está comprendida entre los 400 y 700 nanómetros. Cuando se ilumina un objeto, los puntos de su superficie reflejan las ondas luminosas. Dos puntos próximos de la superficie se verán distintos si la distancia que los separa es grande comparada a la longitud de onda que reciben. Si la distancia que los separa es inferior a la longitud de onda que los ilumina los percibiremos como dos puntos unidos. De nada sirve en este caso aumentar el poder amplificador del microscopio ya que aumentaríamos el tamaño de de la mancha difusa procedente de la unión de los dos puntos pero sin conseguir verlos separados. Definimos por tanto el poder separador de un microscopio como la capacidad que posee este para separar nítidamente las imágenes de dos puntos próximos.

2. El microscopio óptico 2.1. Introducción El microscopio es una herramienta óptica muy relevante, ya que desde su creación fue posible poder apreciar elementos y organismos ciertamente diminutos que antes de su invención no podían visualizarse. Por eso es que su llegada a comienzos del siglo XVII, marcó un salto en este sentido y una de las grandes beneficiadas, fue la investigación científica que encontró en él un gran aliado, y soporte a la hora de avanzar en ciertas investigaciones que justamente implicaban el conocimiento de elementos y organismos muy pequeños. Por tanto el microscopio es aquel instrumento óptico que está compuesto por unas lentes que son las encargadas de ampliar las imágenes que se reflectan. El microscopio óptico se emplea para examinar objetos transparentes, o láminas muy finas.

2.2. Partes del microscopio óptico  Sistema mecánico Está constituido por: el pie, el tubo, el revólver, la columna o brazo, la pletina, el carro, el tornillo macrométrico y el tornillo micrométrico. ›

El pie del microscopio óptico deber ser estable, sólido y amplio ya que constituye la base del microscopio

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El tubo tiene forma cilíndrica y por dentro es de color negro para evitar las molestias del reflejo de la luz. Al final del tubo es dónde se colocan los oculares El revólver es una pieza giratoria en la que se enroscan los objetivos. Cuando giramos este objetivo, los objetivos pasan por el eje óptico del tubo y se colocan en posición de trabajo. La columna es la pieza de la parte posterior del microscopio anclada al pie, sostiene el tubo y la platina.

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La pletina de un microscopio óptico, es una pieza horizontal metálica plana en la que se coloca la muestra a observar. Tiene un orificio en el eje óptico del tubo que permite que pase el rayo de luz en dirección a la muestra. La pletina puede ser fija o giratoria. Si es giratoria, mediante tornillos puede centrarse o moverse con movimientos circulares.

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El carro permite mover la muestra con un movimiento ortogonal, hacia adelante y atrás, o de derecha a izquierda.

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Los tornillos de enfoque permiten regular la distancia entre la muestra y los objetivos, a fin de enfocar la preparación, obteniendo una imagen nítida. 

El tornillo macrométrico, ofrece un enfoque “grueso” permitiendo enfocar rápidamente la preparación

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El tornillo micrométrico, ofrece un enfoque “fino” permitiendo alcanzar una imagen nítida a través del movimiento casi imperceptible de la platina. Los movimientos son a través de un tambor que tiene divisiones de 0,001 mm. Y que también sirve para medir el grosor de los objetos acoplados.

 Sistema óptico Está constituido por: los oculares, los objetivos, el condensador, la fuente de iluminación, el diafragma y el transformador. ›

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Los oculares son los sistemas de lentes más cercanos a la mira del observador. Son cilindros huecos en la parte superior del microscopio provistos de lentes convergentes. Los objetivos son las lentes que se regulan mediante el revólver. Son un sistema de lentes convergentes, que se pueden colocar en el eje del tubo para formar la imagen, van colocadas de manera creciente según sus aumentos, haciendo girar el revólver en el sentido de las agujas del reloj. El condensador es un sistema de lentes convergentes que capta los rayos de luz y los concentra en la muestra proporcionando mayor o menor contraste. Tiene un regulador para ajustar la condensación a través de un tornillo. La fuente de iluminación está constituida por una lámpara halógena. Dependiendo del tamaño del microscopio puede tener mayor o menor voltaje.

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Los microscopios pequeños más utilizados en laboratorios tienen un voltaje de 12 V. Esta iluminación se encuentra en la base del microscopio. La luz sale de la bombilla y pasa a un reflector que envía los rayos en dirección a la platina El diafragma se encuentra sobre el reflector de la luz, abriéndolo o cerrándolo podemos regular la intensidad de la luz. El transformador es necesario para enchufar el microscopio a la corriente eléctrica. Algunos transformadores también cuentan con un potenciómetro que sirve para regular la intensidad lumínica del microscopio.

3. Normas de uso 3.1. Manejo de los objetivos El correcto uso de los objetivos es de elevada importancia, sin estos no podríamos obtener una imagen nítida, para ello debemos tener en cuenta: › Siempre se ha de mover suave y lentamente cualquier elemento del microscopio, sin mover nunca este de la mesa hasta finalizar. › Nunca tocar los oculares, ni los objetivos. › No extraer los oculares ni los objetivos a no ser que el fin sea sustituirlos, en dicho caso la operación se realizará con la mayor celeridad posible para evitar contaminar el microscopio con polvo. › Hay que cerciorarse que el portaobjetos esté bien seco para evitar que los objetivos se contaminen con la muestra. › Colocar en primera instancia el objetivo de menor aumento para lograr un enfoque correcto. Permitiendo así la observación de una panorámica del preparado y la ubicación de áreas de interés para su posterior análisis. › Una vez ubicadas las áreas de interés se procede a rotar el revólver y cambiar a objetivos de mayor aumento, girando en el sentido de las agujas del reloj. › Al cambiar de objetivo se debe enfocar única y lentamente girando el tornillo micrométrico. Nunca se debe utilizar el tornillo macrométrico con los objetivos de mayor aumento, pues al estar éste muy cerca del preparado, se corre el riesgo de partirlo. › Una vez finalizada la observación, aleje la platina de los objetivos y coloque en el objetivo de menor aumento.

3.2. El objetivo de inmersión Es un objetivo diseñado para la microscopía de inmersión, técnica utilizada para aumentar el poder de resolución del microscopio. Esto se realiza mediante la inmersión de la lente del objetivo en un líquido de alto índice refractivo, generalmente aceite sintético o agua. El aceite de inmersión no es inerte respecto a los componentes mecánicos y ópticos del microscopio, por lo que una falta de limpieza causaría daños irreversibles al objetivo. Para un adecuado uso de este objetivo se debe tener en consideración: › Se trata de un objetivo con una longitud focal corta. › Se debe poner una única gota de líquido refractivo en el cubreobjetos, o en el objetivo si es un microscopio invertido. › Mover la platina hasta que el objetivo, o el cubre, entre en contacto con el líquido. › Eliminar el aceite/agua después de cada muestra. No añadir cada vez más líquido, el espacio existente entre el cubreobjetos y el objetivo sólo puede acomodar correctamente 1 gota.

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El aceite se elimina usando sólo papel óptico, sin disolvente. Se repite tantas veces y con tantos papeles cómo sea necesario. Si hay restos de aceite seco en el objetivo se debe aplicar una gota de etanol en el papel pasándolo por la lente y posteriormente se usa un papel óptico seco. Nunca se debe usar un objetivo de aire con líquido refractario ya que no está sellado y causaría un daño irreversible. Para evitar que la tensión superficial del líquido desplace la muestra, esta técnica sólo se debe utilizar en muestras fijadas al portaobjetos.

3.3. Mantenimiento Se debe realizar un mantenimiento rutinario para eliminar daños evitables, cómo polvo, pelusas, manchas, estrías, rayaduras o deterioro por el indebido uso del aceite de inmersión. La limpieza sólo se debe realizar a las lentes y estructura exterior Podemos distinguir dos tipos de contaminantes: ›

Partículas de polvo: vidrio, restos de piel, polen, pelusas… Estos pueden ser abrasivos con la lente por lo que hay que eliminarlos con cuidado mediante:  Un pequeño aspirador  Un cepillo suave  Soplando con una pera, nunca con la boca para evitar contaminación.  Con un espray de aire comprimido o nitrógeno que no suelte aceite ni grasa.

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Líquidos: restos de medios de inmersión, medios de cultivo, grasa… Para una óptima limpieza se debe:  Absorber el líquido con papel.  Disolver y limpiar los restos con agua destilad...