Validación DE Medios DE Cultivo Sólidos POR Metodo Ecometríco PDF

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Biología Molecular...

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PRÁCTICA: 3

Microbiología

TABLA DE CONTENIDO OBJETIVO ................................................................................................................................. 3 REVISIÓN DE CONCEPTOS ..................................................................................................... 4 FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA ......................................................................................... 5 MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO ........................................................................................ 8 Material .................................................................................................................................. 8 Reactivos ............................................................................................................................. 10 Equipo .................................................................................................................................. 12 MÉTODOLOGÍA EN DIAGRAMA DE BLOQUES .................................................................... 13 Preparación de Medios de cultivo ...................................................................................... 13 Preparación de Agar Nutritivo, Agar azul de metileno, Agar EC .................................. 13 Método Ecométrico ......................................................................................................... 14 CUESTIONARIO ...................................................................................................................... 16 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 19

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OBJETIVO Que el alumno conozca la importancia de la validación de los medios de cultivo como control de calidad.

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REVISIÓN DE CONCEPTOS Medio de Cultivo: Gran parte de los estudios en microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto es sólo posible si se dispone de los medios de cultivo adecuado. Un medio de cultivo es una preparación líquida o sólida utilizada para el crecimiento, transporte, o mantenimiento de microorganismos. El conocimiento del habitad normal de un microorganismo es a menudo útil para elegir un medio de cultivo apropiado porque sus necesidades de nutrientes reflejan su ambiente natural. Un medio se utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar microorganismos específicos o para facilitar la identificación de una especie en particular. En estos casos, la función de un medio estará también determinada por su composición. (Prescott, Harley, & Klein, 2002) Crecimiento microbiano: En microbiología, la palabra crecimiento se define como un incremento de células a través de la división de una célula. El crecimiento es un componente esencial de la función microbiana, ya que en la naturaleza cualquier célula de la función microbiana, ya que en la naturaleza cualquier célula tiene un periodo de vida finito y la especie se mantiene como resultado del crecimiento continuo de la población. Además de la compresión de los aspectos básicos del crecimiento microbiano, muchas situaciones prácticas hacen necesario el control del crecimiento microbiano. Este tipo de crecimiento es conocido como fisión binaria, en la mayoría de las procariotas, el crecimiento de una célula individual continúa hasta que se divide en dos células nuevas ( binaria expresa el hecho de que se forman dos células a partir de una). (Mardigan, Martinko, & Parker, 2004) Método ecométrico: Es un medio por el cual se evalúa la eficiencia con el cual el medio de cultive sirve para recuperar los diferentes microorganismos, mediante la comparación que se realiza entre un microorganismo referente y un microorganismo interferente. Un parámetro útil para interpretar los resultados es el índice de crecimiento absoluto (ICA), el cual se calculó para determinar la productividad de los medios. (Villalobos, y otros, 2007)

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FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA Teniendo en cuenta que los medios de cultivo seguirán jugando un papel importante en las investigaciones microbiológicas durante el presente siglo, es necesario tomar todas las medidas que garanticen su correcta preparación y esterilización. Se debe controlar su calidad con el fin de comprobar si estos cumplen con sus especificaciones y si la metodología empleada en su preparación es satisfactoria. Laboratorios Liorad es un conjunto de instalaciones tecnológicas y de facilidades auxiliares, destinadas a la producción de parenterales líquidos y liofilizados. Dispone de un departamento de control de la calidad en el que se encuentra ubicado el laboratorio de microbiología que utiliza diferentes medios de cultivo para realizar el monitoreo ambiental de las áreas clasificadas donde se realiza la producción de los parenterales. Los medios de cultivo, una vez preparados, deben someterse a un programa mínimo de análisis que asegure su aceptación, lo que garantiza la validez de los resultados de los ensayos. Teniendo en cuenta lo anterior, se realizó este trabajo con el objetivo de exponer los resultados de la verificación de la calidad de los medios de cultivo utilizados en el monitoreo ambiental. (Lago & Castillo, 2013)

Los microbiólogos clínicos deben asegurar, al máximo nivel permitido por el desarrollo científico y técnico, la fiabilidad de los resultados. Esto implica que, además de reunir los criterios técnicos que aseguren su validez, deben ser realizados con una serie de garantías, que permitan obtener resultados comparables, con independencia del laboratorio que los ejecute. En este sentido, el empleo de métodos de referencia, reconocidos y aceptados, es la herramienta más eficaz para obtener estas garantías. Las actividades relacionadas con la verificación y validación de métodos analíticos han cobrado gran importancia, debido por un lado al continuo desarrollo y actualización de técnicas y equipos analíticos cada vez más complejos, y por otro lado, al interés de los profesionales en garantizar la calidad de sus procesos y resultados. Se describen las definiciones de validación y verificación, las diferentes modalidades de validación/verificación, así como los tipos de métodos y el nivel de validación necesario según sea el grado de normalización. Se comentan las situaciones en las que es obligatoria y/o recomendable la validación/verificación, así como las particularidades que la validación tiene en microbiología.

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Se incide en la importancia de potenciar el uso de las cepas de referencia como control en microbiología y del uso de controles normalizados, así como en la importancia de la participación en programas de evaluación externa de la calidad para poder demostrar competencia técnica. Se hace hincapié en la forma de calcular algunos de los parámetros imprescindibles para la validación/verificación, como son la exactitud y la precisión. (Sala M. L., y otros, 2015) Los métodos microbiológicos se han basado clásicamente y aún se basan esencialmente en la detección y cuantificación de microorganismos según su capacidad de crecer en un medio de cultivo específico y posterior confirmación del aislado mediante ensayos bioquímicos o inmunológicos. El aislamiento en cultivo permite disponer del microorganismo investigado, su identificación, el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos y además facilita la aplicación de marcadores epidemiológicos. Junto al aislamiento en cultivo, la identificación bacteriana tradicional lleva asociada la confirmación del aislado mediante el estudio macro y microscópico de las colonias obtenidas, así como la realización de pruebas bioquímicas, ya sea de un modo independiente o empleando sistemas multipruebas manuales o automatizadas, que permiten incrementar la rapidez y la fiabilidad. Además, la demostración de la presencia de antígenos y/o de ácidos nucleicos constituye la base del denominado diagnóstico directo. El proceso analítico microbiológico obliga a tener en cuenta una serie de características propias de los métodos microbiológicos que van a influir en su forma de validación, así como en el resultado final obtenido. A diferencia de las ciencias físicas y químicas, en Microbiología se trabaja con microorganismos que se multiplican por división binaria y crecen exponencialmente. Además, el número de colonias observadas es solamente una aproximación del número de partículas vivas, y la viabilidad se define como crecimiento por el propio método, que dependerá del medio de cultivo empelado, tiempo y temperatura de incubación. (Sala M. L., Catalá, Gimeno, Martínez, & Olmos, 2013) El análisis ecométrico establece la eficiencia con la cual un medio de cultivo sirve para recuperar una cepa, mediante la comparación que se realiza entre el medio a evaluar y un medio control (Soler, 2006). Esta técnica evalúa tanto la sensibilidad de los medios a la colonización por los microorganismos buscados (productividad) como también la resistencia a la colonización por las cepas que interfieren (selectividad). Un parámetro útil para interpretar los resultados ecomé- tricos es el índice de crecimiento absoluto (ICA) que determina el grado de selectividad y productividad del medio según el caso. Éste denota el último sector de la placa en el cual ha habido un crecimiento significativo. Otro parámetro es el índice de crecimiento relativo (ICR) que relaciona

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los valores de ICA del medio a evaluar con el ICA del medio control (Mossel, 2003) y determina la capacidad que tiene el medio de prueba de recuperar la microbiota de una muestra determinada, frente a un medio nutritivo como lo es el de control La selección del método ecométrico se realizó teniendo en cuenta la comparación con otros como: Miles-Misra, y el de estrías (Michanie, 1992). Según Kornacki et al (2003), entre las ventajas del método ecométrico se destacan la facilidad y rapidez en la ejecución de la prueba, la eficiencia para evaluar varios lotes de medios de cultivo y el uso de un inóculo estandarizado en donde se garantiza la misma cantidad de microorganismo en todas las siembras.

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MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO Material Matraces Erlennmeyer

Probetas 100ml.

250ml. Se utilizan para

Permite medir

la preparación de

volúmenes fácilmente y

disoluciones de

con un ligero grado de

concentración conocida

inexactitud. También se

o para calentar

usa para contener

soluciones

líquidos.

Cajas Petri. Este

Vasos precipitados

instrumento de cristal o

250ml. Se emplea para

plástico que permite ver

procesos de

y observar el crecimiento

precipitación, para

de cultivos

calentar o agitar líquidos, preparar disoluciones, etc.

Espátula. Se utiliza para

Lampara de alcohol.

tomar pequeñas

Sirve para calentar

cantidades de

muestras y sustancias

compuestos que

químicas.

básicamente son en polvo Asas bacteriológicas.

Tubos de ensaye

Sirve para trasportar,

chicos. Permiten ver

arrastrar inóculos desde

los colores y la

la solución madre al

coherencia de los

medio de cultivo.

líquidos contenidos en

También sirve para la

ellos.

realización de frotis

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Micropipeta𝟏𝝁𝒍. La

Puntas micropipeta

micropipeta es un

𝟏𝝁𝒍. Son puntas que

instrumento de

están ajustadas para

laboratorio empleado

volúmenes diferentes.

para succionar y

La punta

transferir pequeños

presenta también en un

volúmenes de líquidos y

volumen de 0,1 µl

permitir su manejo en las

un nivel de líquido

distintas técnicas

claramente visible.

analíticas

Paletizadas en una plataforma gris.

Gradilla. Material de laboratorio que se utiliza para sostener y almacenar gran cantidad de tubos de ensayo.

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Reactivos Agar métodos estándar.

Agar EMB. El Agar Levine

El Agar para Métodos

o Agar EMB Levine es un

Estándar es un medio

medio de cultivo

utilizado para el

usado para el aislamiento y

recuento de bacterias

diferenciación de E. coli,

mesofílicas aeróbias a

tiene un aspecto purpúreo,

partir de agua, aguas

aunque naranja tras su

residuales, alimentos y

esterilización, es semisólido,

productos lácteos.

y está destinado al cultivo en placa.

Agar EC. El Medio EC

Alcohol. Desinfectante con

es utilizado para la

concentraciones del 70% es

detección de bacterias

un potencial bactericida.

coliformes a 37°C y

También se utiliza como

Escherichia coli a elevadas

compuesto de partida en la

temperaturas (44,5°C y

síntesis de diversos

45,5°C). El Medio EC fue

productos.

desarrollado por Hajna y Perry1 en un esfuerzo por mejorar los métodos para la detección de bacterias del grupo de coliformes y de E.

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Escherichia Coli. La

Agua. La calidad del agua

bacteria E. coli normalmente

en el laboratorio es una de

vive en nuestros intestinos,

las principales

donde ayuda a nuestro

preocupaciones de quienes

cuerpo a descomponer y a

intentan llevar a cabo

digerir los alimentos que

experimentos precisos y

comemos.

eficientes

Lamentablemente, ciertos tipos de E. coli (o "cepas") pueden salir de los intestinos y llegar a la sangre.

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Equipo Balanza Analítica.

Autoclave. Permite

Diseñada para medir

trabajar con vapor de

pequeñas masas, en

agua a alta presión y

un principio de un

alta temperatura que

rango menor a un

sirve para esterilizar

gramo

instrumental o alimentos.

Campana de flujo

Incubadora.

laminar. Proporcionan

Mantiene la

un área delimitada por

temperatura, la

superficies fáciles de

humedad y otras

limpiar y desinfectar

condiciones en grado

con un flujo de aire

óptimo, tales como el

filtrado a través de

contenido de dióxido

prefiltros que retienen

de carbono y oxígeno

las partículas más

en su atmósfera

grandes que están

interior

presentes en el aire.

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MÉTODOLOGÍA EN DIAGRAMA DE BLOQUES Preparación de Medios de cultivo Preparación de Agar Nutritivo, Agar azul de metileno, Agar EC. PREPARACIÓN DE AGAR NUTRITIVO, AGAR AZUL DE METILENO, AGAR EC.

Preparar 100 ml de agar nutritivo, Agar azul de metileno y Agar EC de acuerdo a especificaciones del fabricante, homogenizar el medio con agua y esterilizarlo en

Después de esterilizar dejar enfriar hasta una temperatura de 50-55º C.

Distribuir el medio en las placas de Petri que están estériles dentro de una campana de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones.

Dejar que el medio solidifique.

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Método Ecométrico MÉTODO ECOMÉTRICO

Se dividen las placas en cuatro cuadrantes marcados de forma conveniente sobre la base de la caja de Petri de acuerdo con la siguiente figura

A) Representación de las divisiones de la placa de Petri, B) Representación de la secuencia de siembra

Depositar el medio de cultivo a evaluar en una capa cuyo grosor deberá de ser de unos 4 mm.

A partir de cada uno de los cultivos en fase exponencial (mantenidos en crecimiento toda la noche o 18 h), tomar con un asa y trazar sobre la superficie del medio cinco líneas paralelas a las dibujadas en cada cuadrante y una línea central de forma progresiva y sin recargar, retroceder o repisar o esterilizar el asa. Realizar lo mismo con el medio de referencia.

A) Representación de las divisiones de la placa de Petri, B) Representación de la secuencia de siembra

Incubar las placas en forma invertida por 24 h/30°C.

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Transcurrido el tiempo efectuar la lectura de la caja, teniendo en cuenta que cada estría tiene un valor de 0.2 y la central de 1.0

Multiplicar por el número de estrías en los cuales se observa crecimiento absoluto (ICA), si hay crecimiento en las cinco estrías de los cuatro cuadrantes y la estría central (1) el ICA es igual a 5. El ICA es igual al número del cuadrante cuando todas las estrías de este y de los cuadrantes anteriores muestren un crecimiento completo, mientras que no se muestre crecimiento en ninguna estría del cuadrante siguiente.

Efectuar la misma operación con el medio de referencia. Una vez obtenida las lecturas de cada medio ICA, sacar el índice de crecimiento relativo (ICR), comparando el ICA del medio de evaluación y el medio de referencia.

𝐈𝐂𝐑 =

𝐈𝐂𝐀 𝐝𝐞𝐥 𝐦𝐞𝐝𝐢𝐨 𝐞𝐯𝐚𝐥𝐮𝐚𝐝𝐨 𝐈𝐂𝐀 𝐝𝐞𝐥 𝐦𝐞𝐝𝐢𝐨 𝐝𝐞 𝐫𝐞𝐟𝐞𝐫𝐞𝐧𝐜𝐢𝐚

Observaciones: El ICR deberá estar cercano a 1 Para evaluar la productividad de un medio selectivo, se mide teniendo en cuenta que las cepas esperadas deben de dar un ICA no menor de 25-3 Para evaluar la selectividad de un medio, se mide teniendo en cuenta que el microorganismo interferente debe de dar un ICA no mayor de 2.

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CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la importancia de la validación de los medios de cultivo en microbiología? Es fundamental el uso de métodos validados en cualquier sistema de calidad. En particular, la validación de los métodos microbiológicos es de vital importancia por la propia naturaleza de los organismos vivientes, los cuales muestran una considerable capacidad de variaciones genéticas y mutaciones. Es por tanto indispensable la validación de los métodos microbiológicos alternativos. La norma ISO 16140:20036 ha sido diseñada para cubrir esta necesidad tanto para los métodos cualitativos como cuantitativos. El laboratorio debe asegurarse de escoger correctamente el método para el análisis, ajustándose al propósito en cuestión, en especial con los procedimientos de recuentos de microorganismos, y de esta manera obtener resultados efectivos. (González, Rodríguez, & Zhurbenko, 2013)

2. ¿Qué métodos se utilizan para la validación de medios de cultivo? 

Normalizado: Este método está alineado a las exigencias estándares y es aplicado según lo prescrito en la norma. Debe cumplir estrictamente una serie de parámetros estadísticos tanto en ensayos cuantitativos como cualitativos



Modificado: Está fundamentalmente basado en un método normalizado, pero por razones de tiempo–temperatura, equipos, medio de cultivo u otras razones, alguno de los parámetros ha sido alterado por lo que requiere mayor atención para evitar errores debido al cambio introducido.



Alternativo: Es cuando el laboratorio posee otros medios para realizar una comprobación rápida pero eficaz del método. En este caso los datos son facilitados por parte del fabricante y evaluados por tercer...