Verslag Klinische biologie 1 deel Geeraerts PDF

Preview

Summary

Tijdens de labo’s klinische en moleculaire diagnostiek 1 worden verschillende technieken, pre-PCR, geoptimaliseerd. DNA van stafylokokken wordt geëxtraheerd aan de hand van drie verschillende extractie methoden en het berekenen van de DNA-concentratie wordt bepaald a.d.h.v. twee verschillende toeste...

Description

Erasmushogeschool Brussel Departement gezondheidszorg Biomedische Laboratoriumtechnologie 1 Lab Klinische en Moleculaire Diagnostiek 1

Verslag klinische en moleculaire diagnostiek 1: Alternatieve protocollen om bacterieel DNA te extraheren

Auteurs : Camille Ceyssens en Douâe El-imrani Groep 5 Team 1 Docent : S. Geeraerts Academiejaar : 2018-2019

Inhoud Afkortingenlijst...........................................................................................................................................3 1.

Inleiding...............................................................................................................................................4

2.

Doel..................................................................................................................................................... 4

3.

Materiaal.............................................................................................................................................5

4.

Methoden & berekeningen.................................................................................................................6 4.1. Eerste methode met hitte water:......................................................................................................6 4.2. Tweede methode met lysebuffer:.....................................................................................................6 4.2.1. Berekeningen:................................................................................................................................6 4.3. Derde methode: “Boiling” methode.................................................................................................6 4.3.1. Berekeningen:................................................................................................................................7

5.

Resultaten...........................................................................................................................................8 5.1. Nanospec:.........................................................................................................................................8 5.1.1. Resultaten van de hitte water methode:....................................................................................8 5.1.2. Resultaten van het lysebuffer methode:....................................................................................9 5.1.3. Resultaten van de “Boiling” methode:.....................................................................................10 5.2. Multiscan:.......................................................................................................................................12 5.2.1. Resultaten van de hitte water methode:..................................................................................12

6.

Bespreking.........................................................................................................................................17

7.

Conclusie...........................................................................................................................................18

8.

Literatuurlijst.....................................................................................................................................19

Afkortingenlijst EDTA SDS NaOH NaCl DNA dsDNA Epje PCR S.epidermis S.aureus rpm μL MM t.o.v. a.d.h.v.

Ethyleendiaminetetra-azijnzuur Natrium (sodium) dodecylsulfaat Natriumhydroxide Natriumchloride Desoxyribonucleïnezuur Dubbelstrengig DNA Eppendorftube Polymerasekettingreactie Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Rond per minuut Microliter Molaire massa Ten opzichte van Aan de hand van

1.Inleiding Tijdens de labo’s klinische en moleculaire diagnostiek 1 worden verschillende technieken, pre-PCR, geoptimaliseerd. DNA van stafylokokken wordt geëxtraheerd aan de hand van drie verschillende extractie methoden en het berekenen van de DNA-concentratie wordt bepaald a.d.h.v. twee verschillende toestellen, de Nanospec en de MultiScan, waarbij nagegaan wordt welke de beste resultaten geeft. Een PCR zelf wordt hier niet uitgevoerd.

2.Doel DNA-extractie gebeurt voornamelijk aan de hand van alkalische lyse. Doorheen de jaren werden er talrijke technieken ontwikkeld. De drie grote stappen van DNA-extractie uit cellen zijn: het openbreken van de cel (cellyse), het scheiden van het DNA van de andere cel componenten en het DNA isoleren (Kelly M. Elkins, 2013). Er worden drie verschillende technieken uitgevoerd en vergeleken om te zien welke het beste resultaat verkrijgt. De eerste uitgevoerde methode is een zeer simpele methode - dat weinig tijd inpakt - waarbij cellen in gedistilleerd water worden opgewarmd om deze te lyseren. Het gebruik van warmte voor DNA-extractie van bacteriële cellen, is niet nieuw. Hoge temperaturen veroorzaken schade aan de celmembranen en celwanden. Verwarmen bij 94°C voor 2minuten is al genoeg om een celwand te denatureren (Jose JJ, 2006). Voor de tweede methode wordt er gebruik gemaakt van een sterk alkalische oplossing, een lysebuffer, bestaande uit het detergens natrium dodecyl sulfaat (SDS) en het sterke base natriumhydroxide (NaOH). SDS zal de celwand verstoren zodat NaOH in contact kan komen met het DNA en deze kan denatureren. De laatste gekozen methode komt uit het artikel “Determination of Plasmid Copy Number by the “Boiling” Method”. Hier wordt allereerst gebruik gemaakt van een bufferend zout en een ionisch zout om respectievelijk de pH en de osmolariteit van het lysaat te regelen. Tris wordt gebruikt om de pH tussen 7 en 9 te krijgen, wat een bruikbaar bufferbereik is aangezien het kenmerkend is voor de meeste levende organismen. Bovendien ontstaat er een reactie van Tris waarschijnlijk met het lipopolysaccharide in het membraan, wat dient om de membraan te destabiliseren (Alex Tan, 2018). Natriumchloride (NaCl) zal de ion-sterkte in de bufferoplossing vaststellen. Naast Tris en NaCl worden hier ook EDTA, sucrose, Triton X100 en lysozyme toegevoegd. Triton X-100 is een niet-ionisch detergent en verstoord de celwand zonder eiwitfuncties te verstoren. Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bindt tweewaardige kationen zoals calcium en magnesium. Aangezien deze ionen de integriteit van de celmembraan helpen te behouden, verstoort EDTA het membraan (Alex Tan, 2018). Sucrose wordt toegevoegd om de osmotische druk te verhogen en dus te helpen bij lyse van de cel. Het enzym lysozyme wordt ook gebruikt om de celwand af te breken. Het kwantificeren van het geëxtraheerd DNA door de verschillende methoden wordt spectrofotometrisch uitgevoerd a.d.h.v. de Nanodrop en de MultiScan en de kwaliteit van het geëxtraheerde DNA wordt geschat uit de verhouding van absorptie bij 260 en 280nm en de verhouding 260 en 230nm. Respectievelijk moeten de verhoudingen tussen 1,8 en 2,0 en 2,0 en 2,2 liggen om te spreken over zuiver DNA.

3. Materiaal                            



SDS NaOH NaCl Tris Triton X-100 Sucrose Lysozyme Gesteriliseerd water Lysebuffer EDTA HClO4: 0.3M (ijskoud) en 1M Bunsenbrander + aansteker Spatel Entnaald Weegschaal Maatcilinder Maatkolven: 25ml, 50ml en 100ml Pipettipjes Micropipetten Pipetten: 1ml, 2ml en 3ml Steriele epjes Parafilm Centrifuges Nanospec Multiscan Ijsblok + isomobox Heatblok: 100°C Warmwaterbad: 85°C en 95°C (incubator) Biohazard afvalbak + plastiek vuilzak

4. Methoden & berekeningen 4.1. Eerste methode met hitte water: 5-10 kolonies van agar plaat worden in 200 µL gedestilleerd water in een epje gesuspendeerd door gebruik te maken van een micropipet. De stalen worden voor 20 minuten bij 100°C gekookt, daarna moeten zij voor 5 min op ijs afgekoeld worden. Vervolgens worden deze voor 3 min bij 13000 rpm gecentrifugeerd.

4.2. Tweede methode met lysebuffer: Van elke geïncubeerde plaat werd één enkelvoudige opgezuiverde kolonie (of een klein groepje van 3 kolonies) opgepikt met behulp van een entnaald. Elke kolonie werd met 20μL lysebuffer in een steriel epje gebracht. Daarna werden de epjes in een warmwaterbad van 95°C voor 5min geïncubeerd. Na de incubatie werden de stalen kort gecentrifugeerd en er werd 180μL steriel water toegevoegd. Daarna werden de stalen voor 5min bij 13000rpm gecentrifugeerd. Vervolgens werd het supernatans dat het DNA bevat in een nieuw steriel epje overgebracht, waardoor de pellet achter blijft. Het supernatans werd op ijs bewaard. Door gebruik te maken van de Nanodrop werden de concentraties aan DNA van de stalen bepaald.

4.2.1. Berekeningen:  100mL lysebuffer: NaOH 0.05N : 0.05 mol —> 1L ; 0.005 mol —> 100 mL m = n . MM = 0.005 mol . 40g/mol = 0.2g = 200mg Er wordt 200mg NaOH afgewogen en overgebracht in een maatkolf van 100ml. Deze wordt aangelengd met dH2O. SDS 0.25% in 100mL NaOH (0.05M) : 0.25% = 0.25g/ 100mL Er wordt 250 mg SDS afgewogen en overgebracht in een maatkolf van 100mL. De maatkolf wordt aangelengd met 0,05M NaOH-oplossing.

4.3. Derde methode: “Boiling” methode 3-5 kolonies worden met behulp van een entnaald opgepikt. Elke staal wordt in een steriel epje met 50mM NaCl, 10mM Tris (pH 7.4) gebracht en daarna gecentrifugeerd. De pellet wordt daarna in 1.4 mL van 0.005M Tris, 0.005M EDTA, 8% sucrose, 5% Triton X-100 en + 100µL van Lysozym (20mg/mL): Weeg 1g van lysozyme en voeg 50ml dH2O toe (20 mg in 1 ml). Het epje wordt gekookt en naar hittewaterbad voor 40 seconden overgebracht. Het epje wordt daarna op ijs afgekoeld en voor 20min bij 15000-20000rpm gecentrifugeerd bij 4°C. In de pellet dat nu gevormd wordt zit het chromosomaal DNA.

Het supernatans wordt in een nieuw, steriel epje overgebracht en met gelijke volume 0,6M HClO 4 gemixt om de plasmide DNA te laten precipiteren. Deze wordt op ijs geïncubeerd voor 15min en vervolgens gedurende 10min gecentrifugeerd bij 5000rpm en 4°C. De gevormde pellet bevat het plasmide DNA. Hierna wordt er enkel nog met de pellet van het chromosomaal DNA gewerkt aangezien deze ook degene is dat in de andere technieken geïsoleerd wordt. De pellet wordt vervolgens gewassen met 2ml ijskoude 0,3M HClO4. De supernatans wordt verwijderd en de pellet wordt gesuspendeerd in 2ml van 1M HClO4 en gehydrolyseerd bij 85°C voor 30min.

4.3.1. Berekeningen:  in 20ml eindvolume: NaCl: 0,05M: n = c * V = 0,05mol/l * 0,02l = 0,001mol in 20ml MM = 58,44g/mol  m = n * MM = 0,05844g voor 0,001mol in 20ml Tris: 0,01M: n = c * V = 0,01mol/l * 0,02l = 0,0002mol in 20ml MM = 121,136g/mol  m = n * MM = 0,02423g voor 0,0002mol in 20ml

 in 50ml eindvolume: Tris: 0,05M: 0,0025mol in 50ml – MM = 121,136g/mol  0,30284g (302,8mg) voor 0,0025mol EDTA: 0,005M: 0,00025 in 50ml – MM = 299,24g/mol  0,07481g (74,8mg) voor 0,00025mol Sucrose: 8%: 8g in 100ml – 4g in 50ml Triton X-100: 5%: 5ml aangelengd met 95ml dH2O – 2,5ml in 50ml Lysozyme: 20mg/mL- 1000mg/50ml  1g in 50ml

 verschillende HClO4 concentraties (20% HClO4 als start): - 20% HClO4: 20g in 100ml = 200g in 1l - 1M: 1mol/l en MM = 100,46g/mol  100,46g/l  we verdunnen de 20% HClO4 twee keer om de 1M HClO4 oplossing te verkrijgen. Hiervoor wordt 5ml 20% HClO4 in een maatkolf gepipetteerd en 5ml gedistilleerd water wordt er aan toegevoegd en dit wordt gehomogeniseerd. - 0,3M: 1,5ml 1M HClO4 met 3,5ml gedistilleerd water.

5. Resultaten 5.1. Nanospec: 5.1.1. Resultaten van de hitte water methode: Staal: S. epidermidis Nucleic Acid conc. (ng/µL) : 5.60 OD260/280

: 3.85

OD260/230

: -17.44

Figuur 1: Resultaten van de Nanospec-analyse van staal S.epidermidis. De grafiek geeft de absorbantie (y- as) t.o.v de golflengte (x-as)

Item OD260 OD280 OD230

Result 0.038 -0.042 -0.081

Figuur 1 geeft de resultaten weer van de analyse van het DNA van het staal S. epidermidis in de vorm van een tabel en een grafiek voor. Uit de tabel kunnen we concluderen dat de concentratie van dit staal gelijk is aan 5.60 nanogram per microliter (ng/µL); uit de OD260/OD280 dat dit staal niet zuiver is van contaminerende proteïnen aangezien deze waarde niet tussen de 1,8 en 2,0 ligt; uit de OD260/OD230 dat dit staal gecontamineerd is met organische componenten aangezien deze waarde niet tussen de 2,0 en 2,2 ligt. (Peeters, T., Behets, J., & Kronenberger, P. 2017)

Staal: S.aureus Nucleic Acid conc. (ng/µL) : 13.68 OD260/280

: 2.47

OD260/230

: 1.81

Item OD260 OD280 OD230

Result 0.195 0.032 0.073

Figuur 2: Resultaten van de Nanospec-analyse van staal S.aureus De grafiek geeft de absorbantie (y-as) t.o.v de golflengte (x-as)

Figuur 2 geeft de resultaten weer van de analyse van het DNA van het staal S. aureus in de vorm van een tabel en een grafiek. Uit de tabel kunnen we concluderen dat de concentratie van dit staal gelijk is aan 13.68 nanogram per microliter (ng/µL); uit de OD260/OD280 dat dit staal niet zuiver is van contaminerende proteïnen aangezien deze waarde niet tussen de 1,8 en 2,0 ligt; uit de OD260/OD230 dat dit staal gecontamineerd is met organische componenten aangezien deze waarde niet tussen de 2,0 en 2,2 ligt. (Peeters, T., Behets, J., & Kronenberger, P. 2017)

5.1.2. Resultaten van het lysebuffer methode: Staal: S.epidermidis Nucleic Acid conc. (ng/µL) : 11,19 OD260/280

: 2.68

OD260/230

: 1.82

Item OD260 OD280 OD230

Result 0.133 -0.008 0.032

Figuur 3: Resultaten van de Nanospec-analyse van staal S.epidemidis De grafiek geeft de absorbantie (y-as) t.o.v de golflengte (x-as)

Figuur 3 geeft de weer resultaten van de analyse van het DNA van het staal S. epidermidis in de vorm van een tabel en een grafiek. Uit de tabel kunnen we concluderen dat de concentratie van dit staal gelijk is aan 11.19 nanogram per microliter (ng/µL); uit de OD260/OD280 dat dit staal niet zuiver is van

contaminerende proteïnen aangezien deze waarde niet tussen de 1,8 en 2,0 ligt; uit de OD260/OD230 dat dit staal gecontamineerd is met organische componenten aangezien deze waarde niet tussen de 2,0 en 2,2 ligt. (Peeters, T., Behets, J., & Kronenberger, P. 2017)

Staal: S.aureus Nucleic Acid conc. (ng/µL) : 47.74 OD260/280

: 2.20

OD260/230

: 1.42

Item OD260 OD280 OD230

Result 0.922 0.401 0.639

Figuur 4: Resultaten van de Nanospec-analyse van staal S.aureus De grafiek geeft de absorbantie (y-as) t.o.v de golflengte (x-as)

Figuur 4 geeft de resultaten weer van de analyse van het DNA van het staal S. aureus in de vorm van een tabel en een grafiek. Uit de tabel kunnen we concluderen dat de concentratie van dit staal gelijk is aan 47.74 nanogram per microliter (ng/µL); uit de OD260/OD280 dat dit staal niet zuiver is van contaminerende proteïnen aangezien deze waarde niet tussen de 1,8 en 2,0 ligt; uit de OD260/OD230 dat dit staal gecontamineerd is met organische componenten aangezien deze waarde niet tussen de 2,0 en 2,2 ligt. (Peeters, T., Behets, J., & Kronenberger, P. 2017)

5.1.3. Resultaten van de “Boiling” methode: Staal: S.epidermidis Nucleic Acid conc. (ng/µL) : 8.71 OD260/280

: 0.70

OD260/230

: 0.72

Item OD260 OD280 OD230

Result 0.085 0.160 0.559

Figuur 5: Resultaten van de Nanospec-analyse van staal S.epidermidis De grafiek geeft de absorbantie (y-as) t.o.v de golflengte (x-as)

Figuur 5 geeft de resultaten weer van de analyse van het DNA van het staal S. epidermiss in de vorm van een tabel en een grafiek. Uit de tabel kunnen we concluderen dat de concentratie van dit staal gelijk is aan 8.71 nanogram per microliter (ng/µL); uit de OD260/OD280 dat dit staal niet zuiver is van contaminerende proteïnen aangezien deze waarde niet tussen de 1,8 en 2,0 ligt; uit de OD260/OD230 dat dit staal gecontamineerd is met organische componenten aangezien deze waarde niet tussen de 2,0 en 2,2 ligt. (Peeters, T., Behets, J., & Kronenberger, P. 2017)

Staal: S.aureus Nucleic Acid conc. (ng/µL) : 14.29 OD260/280

: 0.66

OD260/230

: 0.24

Item OD260 OD280 OD230

Result 0.159 0.304 1.077

Figuur 6: Resultaten van de Nanospec-analyse van staal S.aureus De grafiek geeft de absorbantie (y-as) t.o.v de golflengte (x-as)

Figuur 6 geeft de resultaten weer van de analyse van het DNA van het staal S. aureus in de vorm van een tabel en een grafiek. Uit de tabel kunnen we concluderen dat de concentratie van dit staal gelijk is aan 14.29 nanogram per microliter (ng/µL); uit de OD260/OD280 dat dit staal niet zuiver is van contaminerende proteïnen aangezien deze waarde niet tussen de 1,8 en 2,0 ligt; uit de OD260/OD230 dat dit staal gecontamineerd is met organische componenten aangezien deze waarde niet tussen de 2,0 en 2,2 ligt. (Peeters, T., Behets, J., & Kronenberger, P. 2017)

5.2. Multiscan: 5.2.1. Resultaten van de hitte water methode: Staal: S. epidermidis

Figuur 7: Resultaten van de Multiscan-analyse van S.epidermidis. De grafiek geeft de absorbantie (y-as) t.o.v de golflengte (x-as) weer.

Figuur 7 geeft de resultaten weer van de analyse van het eerste staal DNA staal weer in de vorm van een tabel en een grafiek. Uit de tabel kunnen we concluderen dat de concentratie van dit staal gelijk is aan 4.31 nanogram per milliliter (ng/mL); uit de OD260/OD280 dat dit staal niet zuiver is van contaminerende proteïnes aangezien deze waarde niet tussen de 1,8 en 2,0 ligt; uit de OD260/OD230 dat dit staal gecontamineerd is met organische componenten aangezien deze waarde niet tussen de 2,0 en 2,2 ligt. (Peeters, T., Behets, J., & Kronenberger, P. 2017)

Staal: S. aureus

Figuur 8: Resultaten van de Multiscan-analyse van S.aureuss. De grafiek geeft de absorbantie (y-as) t.o.v de golflengte (x-as) weer.

Figuur 8 geeft de resultaten weer van de analyse van het eerste staal DNA staal weer in de vorm van een tabel en een grafiek. Uit de tabel kunnen we concluderen dat de concentratie van dit staal gelijk is aan 12.5 nanogram per milliliter (ng/mL); uit de OD260/OD280 dat dit staal niet zuiver is van contaminerende proteïnes aangezien deze waarde niet tussen de 1,8 en 2,0 ligt; uit de OD260/OD230 dat dit staal gecontamineerd is met organische componenten aangezien deze waarde niet tussen de 2,0 en 2,2 ligt. (Peeters, T., Behets, J., & Kronenberger, P. 2017)

5.2.2. Resultaten van het lysebuffer methode Staal: S. epidermidis

Figuur 9: Resultaten van de Multiscan-analyse van S.epidermidis. De grafiek geeft de absorbantie (y-as) t.o.v de golflengte (x-as) weer.

Figuur 9 geeft de resultaten weer van de analyse van het eerste staal DNA staal weer in de vorm van een tabel en een grafiek. Uit de tabel kunnen we concluderen dat de concentratie van dit staal gelijk is aan 4.31 nanogram per milliliter (ng/mL); uit de OD260/OD280 dat dit staal zuiver is van contaminerende proteïnes aangezien deze waarde tussen de 1,8 en 2,0 ligt; uit de OD260/OD230 dat dit staal niet gecontamineerd is met organische componenten aangezien deze waarde tussen de 2,0 en 2,2 ligt. (Peeters, T., Behets, J., & Kronenberger, P. 2017)

Staal: S. aureus

Figuur 10: Resultaten van de Multiscan-analyse van S.aureus. De grafiek geeft de absorbantie (y-as) t.o.v de golflengte (x-as) weer.

Figuur 10 geeft de resultaten weer van de analyse van het eerste staal DNA staal weer in de vorm van een tabel en een grafiek. Uit de tabel kunnen we concluderen dat de concentratie van dit staal gelijk is aan 9.51 nanogram per milliliter (ng/mL); uit de OD260/OD280 dat dit staal zuiver is van contaminerende proteïnes aangezien deze waarde tussen de 1,8 en 2,0 ligt; uit de OD260/OD230 dat dit staal gecontamineerd is met organische componenten aan...