Lab klinische verslag 2 spectrofotometrie PDF

Preview

Summary

Spectrofotometrische bepalingen: alkalische fosfatase activiteit
en totaal eiwit albumine/globuline. 1 BMLT...

Description

Labo 2: AF- & EW-bepaling

Labo 2: Sp Speectrofotometrische bepalingen en:: alkalilissche fos osffatase act ctiivi vitteit en totaal ei eiw wit alb lbu umine/globuline. A. Kinetische bepalin bepaling g van de activiteit van alkalische fosfatase in serum 1) Berekeningen voor de bufferoplossing Totale volume buffer nodig: 50 mL Inhoud buffer:  Diethanolamine (DEtA), pH 9,8 (1,2 mol/L)  MgCl.6H2O (0,6 mol/L) DEtA n=C*V

m = n * MM

n = 1,2 M * 0,050 L

m = 0,06 mol * 105,137 g

n = 0,06 mol

m = 6,31 g

➔ 6,31 g DEtA afwegen.

MgCl n=C*V

m = n * MM m = 3*10-5 mol * 203,3 g

n = 0,6 M * 0,050 L n = 3*10-5 mol

m = 0,0061 g

➔ 0,0061 g MgCl.6H2O afwegen.

2) Verwerking resultaten Tijd (minuten) 0 1 2 3 4

Absorbantie 0,0011 0,0229 0,0427 0,0594 0,0753

Tabel 1: De absorbanties van de bufferoplossing + p-nitrofenylfosfaat met het serumstaal gemeten na 0, 1, 2, 3 en 4 minuten bij 405 nm.

Labo Klinische en Moleculaire diagnostiek

2019-2020

Labo 2: AF- & EW-bepaling

0.09

Absobantie (bij 405nm)

0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 y = 0.0185x + 0.0033 R² = 0.9953

0.02 0.01 0 0

1

2 3 Tijd (minuten)

4

5

Grafiek 1: De absorbanties van de bufferoplossing + p-nitrofenylfosfaat met het serumstaal gemeten na 0, 1, 2, 3 en 4 minuten bij 405 nm.

Tijd (minuten) 0 1 2 3 4

Absorbantie 0,0018 0,0086 0,0156 0,0241 0,0329

Tabel 2: De absorbanties van de bufferoplossing + p-nitrofenylfosfaat met het controlestaal gemeten na 0, 1, 2, 3 en 4 minuten bij 405 nm.

0.035

Absobantie (bij 405nm)

0.03 0.025 0.02 0.015 0.01

y = 0.0078x + 0.0011 R² = 0.9963

0.005 0 0

1

2

3

4

5

Tijd (minuten) Grafiek 2: De absorbanties van de bufferoplossing + p-nitrofenylfosfaat met het controlestaal gemeten na 0, 1, 2, 3 en 4 minuten bij 405 nm.

Labo Klinische en Moleculaire diagnostiek

2019-2020

Labo 2: AF- & EW-bepaling a. Berekenen van ∆A/min: •

Serumstaal: ∆A = A4 – A0 ⇔ ∆A = 0,0753 – 0,0011 = 0,0742 ∆A/min = 0,0742/4 min ⇔ ∆A/min = 0,01855 ⇒ De absorbantie stijgt met een waarde van 0,01855 per minuut.

•

Controlestaal: ∆A = A4 – A0⇔ ∆A = 0,0329 – 0,0018 = 0,0311 ∆A/min = 0,0311/4 min ⇔ ∆A/min = 0,00778 ⇒ De absorbantie stijgt met een waarde van 0,00778 per minuut.

b. Berekeningen van de standaardoplossing van p-nitrofenol •

Molaire extinctiecoëfficiënt: ε = A/(b.c) met b = 1 cm ; A = 1,046 ; c = 30 µM ε = 1,046/(1 x 30.10-6) = 34866 M-1 cm-1

•

Toename concentratie/µmol PNP in het serumstaal: ∆A/min = 0,01855 ⇒ (∆A = ε.b.∆c) ⇔ ∆c = ∆A/(ε.b) ∆c = 0,01855/(34866 x 1) = 5,32.10-7 M (=0,532 µM) ⇒ ∆c/min = 0,532 µM/min Vtotaal = 1000 µL + 20 µL + 250 µL = 1270 µL n = c.V = 0,532.10-6 M x 1270.10-6 L = 6,76.10-10 mol (=0,000676 µmol) ⇒ ∆µmol/min = 0, 0,000676 000676 µmol/ µmol/min min = U

•

Toename concentratie/µmol PNP in het controlestaal ∆A/min = 0,00778 ⇒ (∆A = ε.b.∆c) ⇔ ∆c = ∆A/(ε.b) ∆c = 0,00778/(34866 x 1) = 2,23.10-7 M (=0,223 µM) ⇒ ∆c/min = 0,223 µM/min Vtotaal = 1000 µL + 20 µL + 250 µL = 1270 µL n = c.V = 0,223.10-6 M x 1270.10-6 L = 2,83.10-10 mol (=0,000283 µmol) ⇒ ∆µmol/min = 0, 0,000283 000283 µmol/ µmol/min min = U

•

AP-activiteit voor het serumstaal V= 20 µL AP-activiteit (U/L) = 0,000676 U/20.10-6 L = 33,8 U/L

•

AP-activiteit voor het controlestaal V= 20 µL

AP-activiteit (U/L) = 0,000283 U/20.10-6 L = 14,15 U/L

Labo Klinische en Moleculaire diagnostiek

2019-2020

Labo 2: AF- & EW-bepaling Bespreking en besluit Bij aanvang werd er 6,31 g DEtA (visceuze vloeistof) en 0,0061 g MgCl.6H2O (vaste stof) afgewogen voor het bereiden van de buffer. Beide stoffen werden daarna opgelost in ongeveer 30 mL dH2O. Bij deze proef was het noodzakelijk om een pH van 9,8 te bekomen vooraleer er verder gedaan kan worden. Bij het meten van de pH moet er nagegaan worden of er NaOH of HCl (beide: 2M) toegevoegd moet worden. In ons geval hadden we een pH lager dan 9,8. We hebben vervolgens NaOH toegevoegd om de gewenste pH te bekomen. Voor het meten van de absorbanties na 0, 1, 2, 3 en 4 minuten werd er vervolgens 1000 µL buffer in een proefbuis gepipetteerd en na 1 minuut 20 µL serumstaal (toegankelijk in het labo) toegevoegd. Het meten van de absorbanties bij de controlestalen werd op dezelfde wijze uitgevoerd.

Tijdens dit practicum werd de werkwijze met Diethanolamine-MgCl2 als buffersysteem gebruikt, dus vergelijken we de verkregen resultaten met de referentiewaarden uit de bovenstaande tabel. De verkregen resultaten zijn voor: het serumstaal = 33,8 U/L ; het controlestaal = 14,15 U/L Voor het serumstaal is er te zien dat de waarden verschillen met een factor 10 (t.o.v. de RW), dit zou kunnen beteken dat er oftewel ergens iets fout werd uitgevoerd tijdens het practicum, of dat er een rekenfout werd gemaakt (theoretisch). Wordt de waarde vermenigvuldigd met een factor 10, dan kan er vastgesteld worden dat het serumstaal afkomstig is van een vrouwelijke patiënt tussen de 13 en 17 jaar. Voor het controlestaal kan er niet nagegaan worden of deze klopt doordat er geen lot controlestalen werd meegegeven voor vergelijking. Hierdoor kan er niet met zekerheid besloten worden of er spraken is van een handelingsfout of een rekenfout.

Labo Klinische en Moleculaire diagnostiek

2019-2020

Labo 2: AF- & EW-bepaling

B. Bepaling van totale eiwitgeh eiwitgehalte alte in serum volgens de Biureet meth methode ode via één enkele standaard 1) Verwerking van de resultaten Staal Blanco 1 g/L 2 g/L 4 g/L 5 g/L Verdund serumstaal Onbekend Eiwitstaal

Absorbantie 0 0,11251 0,26992 0,49694 0,56835 0,2407 0,0197

Tabel 3: De absorbanties van standaarden, het verdund serum- en onbekend eiwitstaal bij 540 nm. 0.7 y = 0.1167x + 0.0095 R² = 0.9914

Absorbantie (bij 540 nm)

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

1

2

3

4

5

6

Concentratie (g/L)

Grafiek 3: De absorbanties van standaarden, het verdund serum- en onbekend eiwitstaal bij 540 nm.

Zoals op bovenstaande grafiek te zien, is er duidelijk een fout gebeurt bij het bereiden of het meten van de absorbantie van concentratie 0 g/l (de blanco). Deze is in verhouding met de andere meetwaarden extreem hoog. De 4 andere gemeten absorbanties volgen wel mooi op elkaar. Maar omdat er zo een uitsteker is, zal de 𝑅 2 natuurlijk veel lager liggen.

Oplossingen die dezelfde verbinding bevatten, vertonen eenzelfde spectrum. Is er een verschil waar te nemen in het spectrum van een oplossing met vrije Cu2+-ionen en een oplossing waarbij de Cu2+ een complex vormen met proteïnen. Bij de standaarden hebben we een 𝐶𝑢2+Complex. Bij de onbekende staal en de serumstaal hebben we een oplossing met vrije 𝐶𝑢2+ − 𝑖𝑜𝑛𝑒𝑛.

Labo Klinische en Moleculaire diagnostiek

2019-2020

Labo 2: AF- & EW-bepaling Wat is de concentratie albumine (g/l) in serum en in het onbekende staal (eiwitmengsel)? Concentratie albumine in serum (g/l) kan bepaald worden door de formule 𝐴 = 𝐶 𝑡𝑒 ∗ 𝐶 Aan de hand van deze formule kan de concentratie van het serumstaal berekend worden. De gecorrigeerde absorbantie van de standaarden bedraagt 0,3619 (gemiddelde van de standaard reeks) De gecorrigeerde concentratie bedraagt 3 g/l (gemiddelde van de concentraties) Wanneer we dit invullen in de formule bekomen we: 𝑐 𝑡𝑒 =

𝐴 0,3619 = 𝑔 = 0,12063 𝑔/𝑙 𝐶 (3 𝑙 )

Hieruit kan het totaal eiwitgehalte in serum bepaald worden. De absorbantie van het serumstaal bedraagt 0,2407. Wanneer we dit invullen in de formule bekomen we: 𝐶=

0,2407 𝐴 = = 1,9953 𝑔/𝑙 𝐶𝑡𝑒 0,12063𝑔/𝑙

Hierna moet er ook rekening gehouden worden met de verdunning. Het serumstaal is 25 keer verdund. We bekomen dus: 1,9953𝑔 𝑔 ∗ 25 = 49,8825 → 4,98 𝑔/𝑑𝑙 𝑙 𝑙 Wanneer deze stappen opnieuw gevolgd worden voor het onbekende eiwitstaal, bekomen we een hoeveelheid van 0,1633 g/l

Vergelijk je gevonden concentratie in serum met de normaalwaarde van proteïne in serum. Het totaal eiwit ligt bij gezonde personen tussen 60 - 80 gram per liter (g/l) in serum en tussen 63 - 83 g/l in plasma. De berekende waarde is 49,88 g/l. Hieruit kunnen we stellen dat onze waarden te laag ligt. Dit is ook het geval wanneer we de referentiewaarden zullen bekijken. (Verder in het verslag zal worden uitgelegd wat hier de oorzaak van kan zijn.)

Bereken de extinctiecoëfficiënt uit de ijklijn. 𝑦 = 0,1167𝑥 + 0,0095 ε = 0,1167 (richtingscoëfficiënt)

Liggen de controlestalen binnen het opgegeven bereik (zie lot controlestalen)? En geef aan of het resultaat mag vrijgegeven worden. Er zou een “lot controlestalen” beschikbaar moeten zijn. Dit is in de cursus niet te vinden, en is in het labo niet gegeven. Op deze vraag kan er dus geen antwoord gegeven worden.

Labo Klinische en Moleculaire diagnostiek

2019-2020

Labo 2: AF- & EW-bepaling

Ligt de meetwaarde voor het serumstaal binnen de referentiewaarden of niet? Wat besluit je? Waarde van serumstaal = 4,98 g/dl. Deze waarde ligt buiten de referentiewaarden voor volwassenen, zowel mannen als vrouwen. Voor kinderen van 1 dag tot 6 maanden, zou dit wel een gezonde waarden zijn. Maar ook wanneer deze kinderen dan ouder zijn zou deze waarden te laag liggen.

Waardoor kunnen verhoogde/ te lage waarden veroorzaakt worden? Ve Verhoogde rhoogde ALB: Dit komt alleen voor wanneer de patiënt is uitgedroogd. Ve Verlaagde rlaagde A ALB: LB: Dit kan wijzen op een leverziekte, Ziekte waarbij via de nieren albumine uit het bloed in de urine lekt waardoor het lichaam die albumine gaat verliezen of bij ontstekingen shock en ondervoeding. Ook kan dit wijzen op niet goed functionerende darmen, waardoor het lichaam de eiwitten niet goed kan opnemen en/of verteren. Ook bij een darmontsteking waardoor er eiwitten verloren gaan via de ontlasting. Oorzaken hiervoor zijn bv de ziekte van Crohn of Spruw.

Labo Klinische en Moleculaire diagnostiek

2019-2020...