14- LONG NON Coding RNA - Appunti 14 PDF

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14-LONG NON CODING RNA Una parte significativa del genoma umano codifica i geni che trascrivono lunghi RNA non codificanti, cioè non codificano per proteine (lncRNA). Un gran numero di lncRNA si localizzano nel nucleo, arricchiti sulla cromatina o localizzati in specifici compartimenti subnucleari. I lncRNA nucleari partecipano a diversi processi biologici, tra cui l'organizzazione della cromatina, l'espressione genica trascrizionale e post-trascrizionale, e fungono anche da scaffold strutturali di domini nucleari. scoperti con le nuove tecniche. Alcuni già si conoscevano, es l’RNA lungo Xist, i ribozimi, la telomerasi (enzima fatto da proteina + una molecola di RNA). Si sapeva dell’esistenza di alcuni RNA lunghi ma ne sono stati scoperti altri e per molti di questi è ipotizzata una funzione nella regolazione. Xist partecipa all’evento di regolazione della soppressione dei geni sul cr X, quello della telomerasi non partecipa ad un evento del genere (funge da stampo per l’allungamento dei telomeri). Il 75% del genoma umano è utilizzato per generare trascrizioni senza apparente potenziale di codifica delle proteine, e queste trascrizioni sono classificate come ncRNA. Lunghi RNA non codificanti (lncRNA) sono considerati i trascritti maggiori di 200 nt.  Human GENCODE = (Release version 27) circa 16 000 geni per lncRNA  lncRNA FANTOM5 (Functional Annotation of Mammalian cDNA= cDNA di mammifero con una funzione annotata): 28000 trascrizioni  Database, letteratura, dati RNA-Seq: 270.000 trascrizioni totali Nei diversi database abbiamo diversi numeri genecode è una stima iniziale, poi si è visto che l numero di trascritti è maggiore ma il numero dei geni è minore quindi da uno stesso gene possono generarsi trascriitti diversi. Non è ancora ben chiara, al contrario dei micro, se c’è un processamento. Quello che si sa è che La maggior parte dei lncRNA localizzati nel nucleo sono trascritti dalla RNA polimerasi II e contengono il cap al 5' e una coda di poli(A) al 3'. [Sembra che in alcuni casi possono essere tradotti (sembra abbiano delle “orf” da tradotti), (per vedere se vengono tradotti c’è la tecnica polisom profiling)]. I lncRNA sono espressi a bassi livelli rispetto agli mRNA codificanti proteine e quello che risulta molto chiaro è che sono tessuto- e tipo cellulare-specifici. Funzioni: Una frazione significativa di lncRNA è preferibilmente localizzata nel nucleo, e molti dei lncRNA nucleari ben studiati partecipano all'organizzazione della cromatina, alla trascrizione e al processamento dell'RNA. Inoltre, i lncRNA hanno ruoli essenziali nell'organizzazione dei domini nucleari.

Ruolo dei lncRNA trattenuti nel nucleo nell'organizzazione della cromatina Un numero significativo di lncRNA nucleari si associa alla cromatina e sono classificati come RNA arricchiti di cromatina (cheRNA), chromatin-enriched. Alcuni lncRNA nucleari possono influenzare l'architettura della cromatina interagendo con le proteine cromatiniche, come Switch/sucrose non fermentable (SWI/SNF) o Polycomb repressive complex (PRC), promuovendone il reclutamento e/o l'associazione alla cromatina, controllando così l'attività trascrizionale

Modalità di interazione dei ncRNA col DNA Degli studi hanno fornito prove a sostegno di due tipi di interazione RNA-DNA: 1- L' appaiamento di basi avviene tra la molecola di RNA e uno dei due filamenti di DNA, spostando il secondo per formare un R-loop. 2- Il DNA rimane accoppiato e l'RNA avvolge all'interno della scanalatura principale, formando allo stesso tempo un triplice appaiamento tra le basi di DNA e RNA, si forma una tripla elica. Sono necessari ulteriori lavori per determinare la relativa prevalenza delle due diverse strutture e quali fattori favoriscono l'uno rispetto all'altro. In entrambi i casi, parti separate dell'RNA possono interagire con le proteine, agendo in tal modo come "guide" sequenza-specifiche. In questo caso, una struttura stem-loop è indicata come motivo di interazione per l'RNA binding protein. La capacità degli RNA di legare DNA, proteine e altri RNA fornisce il potenziale per strutture molto più complesse. La sua attività è sempre quella di mediare il legame con una proteina che andrà poi ad agire in quella regione del DNA, sono dei regolatori dell’espressione genica non in maniera diretta ma permettono il legame di proteine che vanno ad agire in regioni specifiche del DNA, proteine che possono essere i modificatori della cromatina i rimodellatori della cromatina, i fattori di trascrizione, attivatori, repressori etc… Un’altra possibilità è che andandosi a legare in regioni specifiche del DNA possano, non interagire direttamente con i modificatori della cromatina, ma fare da ponte tra la proteina in questione e un’altra sul DNA, influenzano l’organizzazione e/o l’attività della cromatina senza interagire direttamente con essa o con i modulatori della cromatina, essi esplicano questa funzione attraverso la loro associazione con altre proteine. Un altro meccanismo che sembra essere molto comune tra gli RNA regolatori (anche quelli circolari e in alcuni casi anche i micro), è quella di agire come “decoy”, esca. Cioè I lncRNA nucleari possono anche influenzare l'espressione genica impedendo l'associazione di specifici fattori cromatinici a specifici loci genici. In tale scenario, un lncRNA agisce come un "esca" e previene l'interazione di proteine, come la istone deacetilasi, metiltransferasi o i complessi di rimodellamento della cromatina, con uno specifico locus genomico.

Sono state messe a punto molte tecniche che permettono o di isolare questi complessi formati tra la proteina e l’RNA e andare poi ad analizzare vedendo in quale regione si sono legati, possono essere purificati utilizzando RNA complementari. Nuove tecniche per determinare l’associazione dei lncRNA con la cromatina genomica: - chromatin isolation by RNA purification (CHIRP) - capture hybridization analysis of RNA targets (CHART) - RNA antisense purification (RAP) Saranno definite nuove intuizioni sulle proprietà di associazione della cromatina e/o sulle funzioni di modulazione della cromatina. Per esempio: - il lncRNA TERRA associato ai telomeri si lega a diversi altri siti sulla cromatina e modula la trascrizione dei geni attraverso l'antagonizzazione dell'attività dell'RNA elicasi ATRX.

lncRNA come regolatori trascrizionali I lncRNA attivano o reprimono la trascrizione agendo localmente [vicino ai siti della loro trascrizione (cis-regulation)] o a distanza [nei siti che si trovano su altri cromosomi (trans-regolazione)]. I lncRNA regolano anche la trascrizione influenzando l'attività, la localizzazione o la stabilità dei fattori di trascrizione (TFs). Es: Nelle cellule tumorali del colon-retto, PURPL lncRNA, attraverso l'associazione con la proteina stabilizzante di p53, MYBBP1A, previene l'assemblaggio complesso di MYBBP1A-p53, destabilizzando così il pool cellulare di p53. In questo caso, PURPL modula indirettamente la trascrizione regolando i livelli di un TF principale, p53. Si è tentati di ipotizzare che diverse centinaia di lncRNA nucleari non ancora caratterizzati contribuiscano alla regolazione genica modulando l'associazione di TF o co-fattori alla cromatina in modo specifico per le cellule o i tessuti. I lncRNA possono modulare l'espressione di più geni Tali lncRNA sono classificati in due gruppi, in base alla posizione genomica dei geni regolati dagli lncRNA: Nel primo gruppo, il lncRNA o il suo loci regolano l'espressione di più geni, che si trovano nelle immediate vicinanze. Questi lncRNA interagiscono con la cromatina, i fattori di trascrizione o le RBP, aumentando così la loro concentrazione locale vicino ai siti di trascrizione degli lncRNA. In altri casi, i lncRNA partecipano attivamente al reclutamento di queste proteine nei loci genomici vicini. Infine, la trascrizione dal locus del gene del lncRNA, ma non l'lncRNA stesso, potrebbe avere un ruolo importante nella regolazione dell'espressione dei geni vicini. Nel secondo gruppo, i lncRNA possono controllare sia l'espressione dei geni vicini, sia di quelli localizzati distanti. Ad es. il lncRNA Paupar, trascritto da un locus a monte del gene Paired Box 6 (PAX6), regola l'espressione di PAX6, così come di diversi altri geni situati su cromosomi distanti, attraverso un meccanismo trascrizione-dipendente. in

I lncRNA regolano anche l'espressione di geni appartenenti a specifici pathways e/o processi biologici specifici. Ad esempio, il lncRNA PINCR indotto da p53 promuove l'upregolazione di un sottoinsieme di geni bersaglio di p53 coinvolti nell'arresto della fase G1 e nell'apoptosi. Questi studi evidenziano un'altra importante funzione dei lncRNA, che consiste nel riunire combinazioni uniche di cromatina e/o proteine per stabilire reti geniche che regolano una particolare via cellulare. I lncRNA nucleari trascritti dalla RNA II hanno anche dimostrato di regolare l'attività di altre RNA polimerasi all'interno della cellula. Ad esempio, i lncRNA come PAPAS e SLERT regolano l'attività dell'RNA Pol I. Gruppo di lncRNA PAPAs= Promotor e pre-rRNA antisenso, comprendono un gruppo di trascritti ad opera della RNA Pol II che sono trascritti nell'orientamento antisenso da una frazione di ripetizioni di rDNA. PAPAS recluta suv4-20h2 istone metil transferasi sui promotori genici di rDNA (DNA ribosomiale) per mediare la repressione del rDNA innescando H4K20me3 e la compattazione cromosomica. Alcune delle sequenze enhancer all'interno del genoma sono trascritte per produrre RNA nucleari, come gli RNA enancher (eRNA), gli elncRNAs e i ncRNAs. In generale, gli eRNA esplicano la funzione di regolare l'espressione di geni vicini codificanti per proteine, con un controllo RNA dipendente. Alcuni eRNA facilitano le interazioni mediatore/mediato cioè facilitano le interazioni di enhancer/promotore attraverso il looping della cromatina o attivano la trascrizione mediata dal promotore. Ad esempio, dopo il trattamento con estrogeni, gli eRNA trascritti da Erα-bound enancers facilitano il looping enhancer-promoter di diversi geni bersaglio di ERα. Oltre a questa cis-regolazione, gli eRNA partecipano anche alle interazioni intracromosomiche a lungo raggio per regolare l'espressione genica.

Nel caso della regolazione genica mediata dall'eRNA, bisogna essere cauti nel decifrare se i trascritti eRNA o la trascrizione dei loci genici portatori di eRNA hanno un ruolo vitale nella regolazione dell'espressione genica. In questo senso, alcuni eRNA potrebbero rivelarsi sottoprodotti di eventi di trascrizione pervasivi dovuti all'attività trascrizionale intorno alle regioni enhancer. Solo la trascrizione non codificante è importante per stabilire un ambiente cromatico permissivo per facilitare la trascrizione Hand2.

LncRNA come regolatori post-trascrizionali Sta diventando sempre più evidente che i lncRNA nucleari regolano l'espressione genica anche influenzando gli eventi post-trascrizionali. Il lncRNA antisenso-FGFR2 promuove lo splicing alternativo del pre-mRNA di FGFR2 epiteliale-specifico. Questo studio scopre il ruolo di un lncRNA nella regolazione dello splicing alternativo specifico del tipo di cellula modulando la struttura della cromatina sottostante. Il lncRNA Pinky (Pnky) neurale-specifico inibisce la neurogenesi modulando lo splicing alternativo mediato da PTBP1 di una serie di geni che controllano la neurogenesi. Infine, diversi studi hanno identificato il coinvolgimento del lncRNA nucleare oncogenico MALAT1 nella regolazione alternativa dello splicing RUOLO DI MALAT1 NELLA REGOLAZIONE GENICA: - conosciuto anche come nuclear-enriched abundant transcript 2 (NEAT2) - è il lncRNA nucleare più abbondante (3000 copies/cell) - è stato inizialmente identificato come un marker prognostico per lo stadio I dell’adenocarcinoma polmonare - è altamente conservato tra le specie di mammifero e suoi ortologhi sono stati identificati in zebrafish, lizard e Xenous. - è espresso in tutti i tessuti, ma i suoi livelli sono strettamente regolati durante alcuni processi fisiologici, come il ciclo cellulare, il differenziamento cellulare attraverso vari meccanisi trascrizionali e post trascrizionali. - fattori trascrizionali come ER/eNOS, Sp1, HIF-2a, and CREB, riconoscono il promotore di MALAT1 e inducono la sua espressione sotto diverse condizioni di stress. - a livello post trascrizionale, la lunga emivita di MALAT1 in molte linee cellulari è attribuita al processamento della sua particolare struttura all’estremità 3’. - l’estremità 3’ del trascritto primario di MALAT1 forma una struttura simile ad un tRNA ed è tagliata dalla RNAse P, portando ad un RNA di 61 nt chiamato mascRNA. Il resto della sequenza dell’estremità 3’ si ripiega in una struttura a tripla elica che la protegge dall’esonucleasi 3’-5’. - È stata vista una correlazione tra la variazione della sua abbondanza con alcuni tipi di tumori, nei tessuti tumorali questo lncRNA era molto abbondante; FUNZIONE MOLECOLARE DI MALAT1: Una gran parte di MALAT1 è localizzata all’interno dei nuclear speckles e interagisce con diverse proteine localizzate in questi domini, inclusi fattori di splicing. I nuclear speckles sono domini nucleari conservati che sono presenti in forma di 10-30 strutture nucleari irregolari. NDs (nuclear domains) are nonmembranous structures that are enriched with a unique set of proteins and RNA. Eukaryotic cells contain several NDs, including the nucleolus, nuclear speckles, and paraspeckles. I nuclear speckles Sono arricchiti con RNAs e proteine coinvolte nel processamento dei pre-mRNA e nell’export dei mRNP. Studi iniziali suggeriscono che gli speackles agiscono come deposito e/o siti di assemblaggio dei fattori di splicing, quindi siti da cui queste proteine sono reclutate per i geni attivi dispersi nel nucleoplasma. Inoltre studi recenti indicano che i nuclear speckles agiscono come domini strutturali che controllano l’efficienza e l’integrazione di diversi step nell’espressione genica, che variano dalla trascrizione allo splicing all’ export dei mRNA. Si propone che MALAT1 controlli l'espressione genica modulando le funzioni attribuite agli speckles, comprese la regolazione genica trascrizionale e post-trascrizionale. Nel nucleo, MALAT1 si trova ad associarsi preferibilmente a geni trascrizionalmente attivi. (Le cellule tumorali in cui MALAT1 è depleto, mostrano un'espressione ridotta dei geni associati al ciclo cellulare o alla metastasi senza influire sul processamento dei loro RNA, il che implica un coinvolgimento diretto di MALAT1 nella regolazione trascrizionale).

Diversi meccanismi: (A) MALAT1 potrebbe fungere da "punto di ancoraggio" per la localizzazione di alcuni geni vicino ai nuclear speackles e facilitarne l'attivazione trascrizionale (B) MALAT1 promuove l'attivazione o la repressione dei geni facilitando l'assunzione di specifici modulatori di cromatina per colpire i geni in modo specifico del tipo di cellula. Inoltre, MALAT1 interagisce con un gran numero di RBP (RNA binding proteins), come i fattori di splicing dei pre-mRNA, hnRNPs e fattori di esportazione dell'RNA. Ad esempio, è stato dimostrato che MALAT1 interagisce con diversi membri della famiglia di fattori di splocing SR che partecipano a diverse fasi di maturazione del RNP, tra cui lo splicing del pre-mRNA, l'esportazione dell'RNA, il decadimento dell'mRNA e la traduzione. Nelle cellule umane, MALAT1 modula la localizzazione delle proteine SR negli speackles e nei siti di trascrizione. In conclusione, MALAT1 potrebbe fungere da "scaffold molecolare" per migliorare le interazioni tra proteine, proteine e RNA e proteine-DNA negli speackles o vicino ad essi. (nucleolo). È come se concentrasse in questa regione del nucleo alcuni tipi di geni e ne promuovesse la regolazione trascrizionale e il processamento post trascrizionale.

La zona in azzurro è quella che delimita i nuclear speckle, in nero c’è il DNA e in verde il lncRNA MALAT1, sono indicate diverse modalità attraverso le quali MALAT1 partecipa al processamento di alcuni mRNA immediatamente dopo la trascrizione, quindi sicuramente MALAT1 è stato localizzato associato a geni che sono trascrizionalmente attivi. A) MALAT1, insieme alle proteine che interagiscono con MALAT1, come la Pc2 non metilata, trasferisce i loci genomici dal nucleoplasma o da altri domini nucleari alla periferia del nuclear speckle e promuove l'attivazione dei geni corrispondenti. (B) MALAT1 interagisce con più modificatori di cromatina e fattori di trascrizione per modulare la trascrizione. (C) MALAT1 funge da scaffold nei nuclear speckles per le proteine che legano l'RNA (RBP) e influenza vari processi coe post-trascrizione. QUINDI Il genoma umano codifica circa 16 000 lncRNA, di cui una frazione significativa viene trattenuta nel nucleo. I lncRNA nucleari sono coinvolti in quasi tutti i processi fisiologici e/o biologici e correlati alle malattie. La maggior parte degli lncRNA nucleari si associa alla cromatina e influenza l'espressione genica in modo cis o trans. I lncRNA associati alla cromatina controllano il reclutamento o la stabilizzazione di varie proteine della cromatina o delle proteine leganti l'RNA a sequenze regolatorie all'interno del gene o dell'RNA, influenzando così i processi trascrizionali o posttrascrizionali. Tuttavia, non sappiamo ancora come gli lncRNA si associno a specifiche regioni di cromatina nel genoma. Alcuni aspetti della specificità potrebbero essere attribuiti alla capacità dei lncRNA di riconoscere il DNA attraverso la formazione di ibridi RNA:DNA. In alternativa, lncRNA potrebbe essere reclutato in un sito di cromatina da proteine associate alla cromatina. La conservazione dei lncRNA nel nucleo e la loro localizzazione in compartimenti nucleari specifici potrebbero essere controllati da attivi o passivi meccanismi regolativi. I lncRNA, come Xist e eRNA, potrebbero essere conservati nel nucleo attraverso la loro associazione con la cromatina. I lncRNA sono anche noti per contenere specifici motivi di sequenza, domini o sequenze di ripetizione al loro interno che potenzialmente agiscono come segnali di ritenzione nucleare. Inoltre, l'associazione delle proteine nucleari ai lncRNA potrebbe garantire la conservazione nucleare degli lncRNA. Studi futuri su un gran numero di lncRNA nucleari aiuteranno a identificare i nuovi meccanismi utilizzati dagli lncRNA per la loro localizzazione nucleare e l'associazione della cromatina.

PYCARD FUNZIONE: Funziona come mediatore chiave in apoptosi e infiammazione. Promuove l'apoptosi mediata da caspasi che coinvolge prevalentemente caspasi-8 e anche caspase-9 in un probabile tipo di cellula in modo specifico. Coinvolto nell'attivazione del percorso apoptotico mitocondriale, promuove la maturazione proteolitica caspase-8-dipendente di BID indipendentemente da FADD in alcuni tipi di cellule e media anche la traslocazione mitocondriale di BAX e attiva l'apoptosi dipendente da BAX all'attivazione della caspasi-9, -2 e -3. Coinvolto nella piroptosi macrofasca, una forma infiammatoria dipendente dalla caspase-1 di morte cellulare ed è il principale costituente del piroposomaas ASC che si forma al momento dell'esaurimento del potassio e recluta rapidamente e attiva la caspase-1. Nella risposta immunitaria innata si credeva di agire come un adattatore integrale nell'assemblaggio dell'infiammazione che attiva la caspase-1 che porta alla lavorazione e alla secrezione di citochine proinfiammatorie. La funzione come adattatore di attivazione in diversi tipi di infiammatori è mediata dai domini pyrin e CARD e dalle loro interazioni omotipiche. Obbligatorio per il reclutamento di caspase-1 a infiammatori contenenti determinati recettori di riconoscimento dei pattern, come NLRP2, NLRP3, AIM2 e probabilmente IFI16. Nel NLRP1 e NLRC4 inflammasomes non sembra essere richiesto, ma facilita l'elaborazione di procaspase-1. In collaborazione con NOD2 coinvolto in un infiammatorio attivato da dipeptide catermlosco batterico che porta all'attivazione di caspase-1. Può essere coinvolto in risposte infiammatorie DDX58-innescato e l'attivazione infiammatoria. Isoform 2 può avere un effetto regolatore sulla funzione come adattatore infiammazione. Isoform 3 sembra inibire la maturazione infiammante mediata di interleucina-1 beta. In collaborazione con AIM2 che rileva il DNA citosolico a doppio filamento può anche essere c...