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BIOCATÁLISIS

3. Unión de ligando X a una macromolécula que posee un único centro de unión: Introducción: En este tema y el siguiente, vamos a estudiar la unión de ligandos a macromoléculas, concretamente dos casos: 1. La macromolécula tiene un único centro de unión para un ligando X. 2. Cuando la macromolécula tiene dos centros de unión distintos, uno para cada ligando (X e Y), distintos entre ellos. Cuando hablemos de cooperatividad y alosterismo hablaremos de macromoléculas con n centros de unión para el mismo tipo de ligando X. Veremos que en este caso son cooperativas y, probablemente, alostéricas, mientras que las otras siguen una cinética principalmente Michaeliana. Hablamos ahora, por tanto, de una propiedad muy importante de las proteínas con actividad biológica (que, como hemos dicho, incluyen las enzimas. pero no están limitados a ellos). Estas moléculas tienen la capacidad de unirse a su ligando de manera específica y reversible. Dicho ligando tiende a ser, salvo excepciones, de menor peso molecular que la enzima. Consideraremos el ligando de una enzima: 1. 2. 3. 4.

Al sustrato, pero también al producto, ya que las reacciones son reversibles. A los cofactores o coenzimas que son necesarios para la actividad enzimática. Al inhibidor y/o activador, en el caso de la regulación. El H+, ligando universal de las enzimas.

Aquí, tenemos que darnos cuenta de que todos los ensayos enzimáticos tienen que ser en medio tamponado. Sin embargo, todo esto que vamos a ver aquí para una enzima lo podemos extender a otro tipo de macromoléculas que no tengan actividad enzimática, pero que tengan capacidad de unirse reversiblemente y específicamente a su ligando. Por ello, a partir de ahora, en estos dos temas, no hablaremos de enzimas, sino, en general, de macromoléculas altamente específicas y especializadas, que se unan de manera específica y reversible a sus respectivos ligandos, como son, por ejemplo, las inmunoglobulinas, los receptores hormonales, permeasas (proteínas transportadoras), etc. Cuando pasemos estos dos temas, hablaremos ya de enzimas en lugar de macromoléculas, y de sustratos en lugar de ligandos. El primer caso, que consideraremos en este tema, es una macromolécula con un solo centro de unión y específica a un único ligando X. Posteriormente, hablaremos de macromoléculas con dos centros de unión distintos para dos ligandos distintos (X e Y) por molécula. Cuando la macromolécula tiene varios centros de unión, estos pueden ser: 1. Equivalentes o idénticos: cuando todos los centros de unión son específicos para un único ligando X. Cuando todos los centros de unión están vacíos, todos tienen la misma afinidad por el ligando, que viene determinada por la constante de equilibrio (Kx): a. Cuando uno de los centros se une a su ligando, puede provocar una alteración de la afinidad de los centros que se encuentren vacíos: en ese caso, se habla de centros equivalentes y 1

BIOCATÁLISIS dependientes. La afinidad de los centros vacíos puede depender del grado de saturación y naturaleza del ligando unido. Si la unión del ligando X a un centro de unión altera la afinidad del resto de centros de unión por dicho ligando, estamos ante un ejemplo de cooperatividad, que puede ser de dos tipos: i. Positiva: cuando la entrada de un ligando facilita o aumenta la afinidad del resto de centros vacíos hacia el ligando; es decir, favorece la entrada de más ligando. ii. Negativa: cuando la entrada del ligando dificulta o disminuye la afinidad del resto de los centros vacíos hacia el ligando. b. Por el contrario, cuando la entrada de ligando al centro no afecta a la afinidad del resto de los centros, se dice que estos son equivalentes e independientes. 2. Específicos para dos ligandos diferentes: en este caso, X sólo podrá unirse al centro específico para él. Su unión puede afectar a la afinidad del centro vacío por su ligando Y, de manera que puede existir dependencia positiva o negativa. Si, por el contrario, la unión de un ligando no afecta a la afinidad del segundo centro por su otro ligando, hablaremos de centros independientes. Sin embargo, en ninguno de estos dos casos podremos decir que exista cooperatividad, puesto que esta palabra sólo se emplea cuando los centros son equivalentes para el mismo ligando. El caso más sencillo es una macromolécula (M) con un único centro de unión para un único tipo de ligando X por macromolécula. En el plano, lo podemos expresar de la siguiente forma:

A la macromolécula se le puede unir el ligando X y se forma el complejo binario M-X. . La constante de disociación del proceso (Kx) mide la afinidad de la unión y se define como 𝐾𝑥 =

[𝑀][𝑥 ]

[𝑀𝑋]

. Nosotros trabajamos con constantes

de disociación, ya que de esa monera podemos homologar las expresiones de unión con las ecuaciones de velocidad de la cinética enzimática, que veremos posteriormente. En bioquímica trabajamos siempre con concentraciones porque se supone que los coeficientes de actividad de los reactantes se aproximan generalmente a la unidad, de manera que son equivalente a las concentraciones.

Conceptos fundamentales: Función de saturación: La función de saturación se representa en este caso como Vx, que se define como la relación entre las concentraciones de ligando unido y la suma de todas las especies de la macromolécula una vez alcanzado el equilibrio. Dicho de otra forma, en el numerador aparecerá las formas de ligando unido (en este caso 1) partido de la suma de todas las especies de la macromolécula. Partiendo de la definición de función de saturación: 𝑉𝑥 = Sustituyendo [mx] por la ecuación [𝑚𝑥] =

[𝑚][𝑥 ] 𝐾𝑥

queda 𝑉𝑥 = 2

[𝑚𝑥]

[𝑚]+[𝑚𝑥] ⌈𝑥 ⌉ 𝐾𝑥 +⌈𝑥 ⌉

=

[𝑚𝑥] [𝑚]𝑇

BIOCATÁLISIS Es la función de saturación más sencilla que vamos a ver, y, si lo comparamos en el caso de una cinética monosustrato, vemos que la ecuación es muy similar a la de una cinética de Michaelis-Menten: 𝑣=

𝑉[𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆]

Evidentemente, la ecuación de saturación presenta cierta similitud con la ecuación de Michaelis-Menten: 1. La constante de equilibrio Kx puede equipararse a la constante de Michaelis Km. Cuanto mayor Kx, menor la afinidad del centro por el ligando (se relacionan de manera inversa). 2. La concentración de x es la de S (sustrato), ligando en la función de Michaelis-Menten. 3. La V (velocidad máxima) sería el límite de esta función, mientras que en el de ahora, como apuntábamos, es 1. Sin embargo, no hay que confundir los términos. En la cinética, tenemos que asumir que es una enzima y que es monosustrato, pero la función de saturación es genérica para macromoléculas. En cuanto a la cinética, el máximo de la ecuación es la velocidad máxima. La función de saturación tiene como máximo la unidad. Esto es debido a que esta función tiene como mínimo 0 (cuando todos los centros de unión se hallan vacíos o desocupados) y el máximo es el número de centros reales de unión de la macromolécula (que, en este caso, dado que n=1, ha de ser 1). Equiparamos, por tanto, ambos máximos. Luego, tendremos la comparación de la constante de Michaelis y la constante de disociación. No son lo mismo, pero se pueden homologar. Función de saturación fraccional: Se define como Yx. La función de saturación fraccional es la relación entre el número de centros ocupados por x y el número de centros totales de la macromolécula. Dicho de otra forma, no es más que la función de saturación partido por el número de centros de la macromolécula. Y, como en este caso el número de centros de unión es 1, la función de saturación es igual a la función de saturación fraccional. 𝑌𝑥 =

𝑉𝑥 𝑛

¿Cuáles son los límites entre los que varía? Tendrá un valor mínimo que es 0, cuando todos los centros estén ocupados, y un máximo de 1, siempre, ya que el máximo de la función de saturación es el número de centros de unión, y aquí se divide entre el mismo número de centros de unión. 1- Vx nos dirá la fracción de centros que están desocupados en un momento determinado, lo cual ahora no tiene particular relevancia pero será importante en casos posteriores.

Representaciones gráficas: Nuestro objetivo es conocer los diferentes parámetros que hemos ido viendo sobre una macromolécula y sus centros de unión, como por ejemplo la afinidad de los centros (Kx), el número de centros de unión (n), la función de saturación (Vx), la función de saturación fraccional (Yx), etc. Para poder calcularlo a partir de los parámetros que están disponibles experimentalmente, emplearemos diferentes ecuaciones matemáticas y representaciones gráficas. Existen varios tipos: Directa: Vx vs [x] o, en este caso, también Yx vs [x]; porque ambos máximos son 1.

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BIOCATÁLISIS En posteriores casos, ya no coincidirá. Siempre se obtiene una hipérbola rectangular equilátera que tiene en ambos casos asintóticamente al valor máximo que es la unidad, represente lo que represente. Lógicamente, eso corresponderá a la macromolécula Mx, está saturada (como el complejo enzimasustrato). En el momento en el que µx=Yx=0,5, el valor de [x] es Kd. Luego, la proyección al eje de abscisas de ese punto de corte dará Kd (Kx), que indica la afinidad de la macromolécula por ese ligando. Doble recíproca (Lineweaver-Bruke):

Se obtiene jugando con la ecuación 𝑉𝑥 =

[𝑥 ]

1 1 1 𝑣𝑠. 𝑜 [𝑥] 𝑉𝑥 𝑌𝑥 . Realizando la inversa, obtenemos:

𝐾𝑥+[𝑥]

1 𝑉𝑥

=

𝐾𝑥 + 1; [𝑥]

lo cual es una

ecuación de una recta de tipo y = mx + b. Luego, realizando la representación de la recta, vemos que en este caso b = 1 y m = Kx, el punto de corte en el eje de ordenadas (b) es el número de centros que es 1, y el punto de corte en X es 1/Kx. Cuando existen dos posibilidades, lo más exacto es el punto de corte, ya que para el cálculo de la pendiente existen más variables (seno, coseno, etc.). Como vemos, el punto de corte en el eje Y da el número de centros reales de la macromolécula, y el valor Kx puede obtenerse o por la pendiente o por el punto de corte en el eje X. Representación de Hill: Es una representación logarítmica, muy importante en alosterismo. Podemos representarla de las siguientes maneras: log log

𝑉𝑥 𝑣𝑠 log⌈𝑥⌉ 𝑛 − 𝑉𝑥

𝑌𝑥 𝑣𝑠 log⌈𝑥⌉ 1 − 𝑌𝑥

De nuevo, esto es la ecuación de una recta, siendo la pendiente la unidad, y b es el punto de corte en el eje de ordenadas. La pendiente que se calcula próxima al eje de abscisas es lo que se conoce como coeficiente de Hill 4

BIOCATÁLISIS (h) que en este caso concreto es la unidad ya que sólo existe un centro de unión. Este coeficiente es de gran importancia cuando hablemos de macromoléculas con varios centros de unión para el mismo ligando y que tenga cooperatividad positiva o negativa. 1. h>1: cooperatividad positiva. 2. h1, h...