3.4 Vectores de clonacion y expresion PDF

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Apuntes sobre vectores de clonacion y expresion, fundamentos y usos...

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3.4 Vectores de clonación y expresión Clonación La clonación de ADN, o clonación molecular, es la introducción de un fragmento de ADN denominado inserto dentro de una molécula de ADN denominada vector, que puede replicarse de manera autónoma e independiente del genoma de la célula hospedera. El resultado es la obtención de millones de copias de una molécula recombinante o clona molecular compuesta por ADN proveniente del inserto y del vector. El inserto puede ser ADN obtenido de cualquier organismo y puede permanecer como ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc), producto de la retrotranscipción del ARN, un producto de PCR o un ARN obtenido por transcripción in vitro. Vectores de clonación Un vector se define como una molécula de ADN de doble cadena (DNAds), con capacidad de albergar un fragmento de ADN exógeno (de otro origen). Clasificación Vectores de clonación Los vectores son de clonación si su finalidad es el almacenamiento de secuencias y la obtención de grandes cantidades del ADN insertado o de la molécula recombinante. Los vectores de clonación suelen ser plásmidos, fagos, fagémidos, cósmidos y cromosomas artificiales bacterianos o de levadura. Vectores de expresión Los vectores de expresión son aquellos cuyo objetivo es producir un transcrito (ARN) o la proteína producto de ese transcrito. Los vectores de expresión pueden ser plásmidos o fagos. Elementos que forman un vector de clonación a) Origen de replicación: es una secuencia en el ADN del vector que provee un sitio único de reconocimiento a las proteínas que identifican el sitio de inicio de la replicación (ORI). Los plásmidos se caracterizan por tener un solo sitio ORI en su genoma y realizar una replicación unidireccional. b) Marcador de selección: es un gen que generalmente confiere resistencia a un antibiótico o genera un fenotipo particular con el cual puede seleccionarse la célula que incorporó el vector. En general, los marcadores de selección son únicos en los vectores, aunque existen algunos plásmidos que contienen dos. Entre los genes de selección más comunes se encuentran los de resistencia a ampicilina y kanamicina.

c) Sitio de clonación múltiple: es un fragmento de ADN que contiene una serie de sitios únicos de reconocimiento para enzimas de restricción, muy cercanos entre sí, con una amplia gama de posibilidades de insertar cualquier fragmento de ADN. Los sitios de restricción más comunes presentes en el sitio de clonación múltiple de la mayoría de los vectores son para las enzimas EcoR I, Hind III, BamH I, Xho I y Kpn I. Plásmidos Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de ADN que se replican y se transmiten con independencia del cromosoma bacteriano. De manera natural constituyen el material genético móvil de las bacterias, donde funcionan como medio de transporte de genes a otras bacterias, como la resistencia a antibióticos. Los plásmidos han sido manipulados genéticamente en el laboratorio con la finalidad de preservar sólo las características deseables, eliminar el ADN innecesario y añadirle otras que no poseen de forma natural. + Los plásmidos usados como vector en general están formados por de 2 a 5 kb de ADN, lo que facilita el análisis de los insertos incorporados a él. Bacteriófagos Son virus que infectan naturalmente bacterias y se comportan como parásitos intracelulares obligados que se multiplican haciendo uso de la maquinaria biosintética de las bacterias. Al igual que los plásmidos, los bacteriófagos se replican de forma autónoma, portan información genética y pueden conferirle a la bacteria nuevas propiedades o desarrollarle procesos patológicos. Para convertirlo en un vector, el bacteriófago silvestre (virus natural) es modificado genéticamente. Dichas modificaciones consisten en la adición de sitios de restricción específicos y la eliminación de aquellos genes que no se requieren para la replicación, lo que permite la incorporación de fragmentos de ADN de mayor longitud que los plásmidos (de hasta 23 kb). El bacteriófago lambda es el fago más utilizado como vector de clonación, y su genoma consiste de una molécula lineal de aproximadamente 45000 pb (45 kb), cuyos extremos son 12 nucleótidos, que contienen secuencias complementarias entre sí, denominados sitios cos, que utiliza para “circularizar” su genoma a través de la acción de una ligasa de la célula huésped.

Cósmidos Los cósmidos son vectores híbridos del ADN de un plásmido (proporciona la resistencia a los antibióticos) y los sitios cos del bacteriófago (le permiten empaquetar el ADN). Los cósmidos derivados del fago P1 pueden admitir 85 kb de ADN exógeno. Además, contienen los genes de selección y un sitio ORI del plásmido, por lo que se replican de manera independiente del genoma bacteriano, como lo hacen los plásmidos Cromosomas artificiales – BACs y YACs Fragmentos de ADN de mayor tamaño (cientos de kb) pueden clonarse en cromosomas artificiales de bacterias (BAC) o levadura (YAC). Un BAC es un constructo derivado del plásmido F (functional fertility plasmid) capaz de regular la distribución equitativa de plásmidos después de la división bacteriana. Usualmente, acepta insertos de 150 a 350 Kb, pero se han clonado segmentos de hasta 700 kb. Los YAC, fueron los primeros vectores en descubrirse, son cromosomas artificiales que contienen telómeros, origen de replicación, un centrómero de levadura y un marcador de selección para su identificación en las células que los contengan. Su capacidad de clonación es de 100 a 1000 kb. Vectores de expresión Los vectores de expresión se emplean con dos finalidades: generar el ARN producto de la transcripción o bien producir la proteína codificada en la secuencia génica que portan (proteína recombinante). Los vectores de expresión son plásmidos o bien bacteriófagos. Componentes de los vectores de expresión En su estructura los vectores de expresión poseen los elementos básicos presentes en los vectores de clonación (origen de replicación, marcador de selección y sitio de clonación múltiple), además de contar en su secuencia con por lo menos un promotor fuerte. Se caracterizan por constituir un sistema de inducción simple y efectivo, tener una baja expresión basal y ser fácilmente transferible a otras cepas. También debe incluir secuencias de terminación de la transcripción y de adición de cola de poliadelinación, pues con ello el tránscrito estará protegido de la degradación de nucleasas, con lo que su vida media se extenderá. Otro factor importante presente en un vector de expresión es el sitio de unión al ribosoma (internal robosome entry site, IRES), que es la secuencia ShineDalgarno que precede el codón de inicio AUG de la traducción en los ARNm

procariotes. Dicha secuencia es complementaria con el extremo 3’ del ARNr 16S, cuya hibridación permite el ensamblaje de la maquinaria de inicio de la traducción. Además, debe considerarse la expresión basal del plásmido, lo que se conoce como número de copias del plásmido, característica determinada por la fuerza del sitio de origen de replicación, que origina plásmidos con un elevado número de copias per se....