6B. Pruebas bioquímicas-Fermentacion de carbohidratos y ureasa PDF

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Universidad central del Ecuador

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Bacteriología y Micología

Docente: Dr. Christina Vinueza Tema: Pruebas bioquímicas: Fermentación de los carbohidratos y Ureasa Daysi Mesa 3ro B 2017-2018

Introducción Las pruebas bioquímicas son técnicas usadas para determinar características metabólicas de un microorganismo que se encuentra sujeto a una investigación. Dichas características van a permitir diferencias las especies, familias y genero de bacterias, esto mediante el uso de medios se cultivó que le van a permitir a la bacteria expresar un proceso metabólico determinado. Los medios son de tipo diferencial y dependiendo de la prueba van a permitir diferenciar sin bacteria tiene la capacidad de sobrevivir a un ambiente, que tipo de respiración posee, si produce determinado productos e enzimas frente a ciertos reactivo etc. Es así que las siguientes pruebas bioquímicas nos van a permitir determinar si una bacteria puede realizar la fermentación de un carbohidrato o si es capaz de desdoblar urea. Estas pruebas son de tipo diferenciales ya que en la primera vamos a detectar componentes metabólicos y en la segunda producción o presencia de un enzima en específica la ureasa. Marco teórico Fermentación de carbohidratos Fundamento bioquímico Su fundamento es determinar si una bacteria es capaz de fermentar un carbohidrato determinado. (MacFaddin, 2003) Esto ya que no todas las bacterias son capaces de fermentar carbohidratos, y aquellas que poseen metabolismo fermentador no son capaces de fermentar todos los carbohidratos. Esta prueba se aplica a bacterias con metabolismo fermentador, las bacterias anaerobias facultativas. Los productos finales de la fermentación que se obtiene con esta prueba son: solo un ácido o formación de ácido y gas. (Cavallini, Coronado, F.Chavarría, & Hidalgo, 2017) Procedimiento Para esta prueba el medio de cultivo que se utiliza es el caldo básico Rojo de fenol, como bien su nombre lo indica es un medio de cultivo nutritivo, de carácter básico pH 7.4 de tipo diferencial ya que nos va a permitir identificar el si la bacteria sometida a la prueba realiza fermentación a un carbohidrato en especial o no, y consistencia liquida. Para evidenciar los productos de la fermentación, el medio contiene un indicador de pH y dentro del caldo se inserta una campa de Durham. (Bailón, Cruz, & Cervantes, 2003) De forma general el cultivo contiene proteínas, uno solo de los carbohidratos que se utilizan como el sustrato a fermentar, un indicador de pH y adicional a este la campanilla de Durham. El indicador de pH va a evidenciar mediante viraje de color si el carbohidrato utilizado para la prueba fue fermentado por la bacteria y la campana de Durham atrapara el gas en caso de que haya producido. A continuación, se detalla un esquema del procedimiento. (Anónimo, 2011 )

Campana de Durham

Indicador de pH

Preparacion del caldo basico Rojo de fenol segun al formulacion indicada por el fabricante

Adición del sustrato a fermentar: Glucosa, Sacarosa, Dextrosa, Lactosa, Manitol

Inocular el caldo con un cultivo en medio solido, evitando incorporar azucares de dicho medio

Colocar dentro del tubo de ensayo donde se encuentra el caldo la campana de Durham de forma invertida

Incubar a una temperatura de 35 a 37º C, duarante 24 horas, se obtiene un caldo rojo rosado

Caldo rojo de fenol, sin campana de Durham

Resultados Resultado positivo: Un resultado positivo se observa que el caldo inicialmente rojo rosado, se torna de color amarillo, esto revela que la bacteria a fermentado el hidrato de carbono y ha producido acido, estos vuelven acido al caldo básico rojo de fenol, por lo cual el indicador de pH rojo de fenol vira de color rojo rosado a amarillo. En un resultado positivo también se puede observar burbujas en la campana de Durham, esto no es nada más que el gas producido por la fermentación y que la campana ha atrapado. (Olivas & Alarcón, 2004 ) Resultado negativo: Un resultado negativo se pueden observar el caldo del color rojo, o color naranja. Cuando el caldo se observa de color naranja revela que la bacteria no ha fermentado el carbohidrato, pero las proteínas del caldo han sido degradadas a entra en contacto con el ambiente o por la misma bacteria. Un resultado de caldo rojo evidencia que la bacteria está formando amoniaco. (Olivas & Alarcón, 2004 ) El tubo A muestra un resultado positivo con formación de gas, el tubo B es positivo, pero sin formación de gas, el tercer tubo en una prueba negativa y el quinto tubo es el caldo sin inocular

Ejemplos: Tabla Nº1: Bacterias que fermenta carbohidratos

Microorganismo Sustrato fermentado Enterobacteriacea Glucosa Staphylococcus aureus Manitol Neriseria lactamica Lactosa Proteus rettgeri Inositol Yersinia enterocolitica Sacarosa En la imagen se muestra una prueba realizada con manitol. En el primer tubo se observa el caldo sin inocular. El segundo tubo esta inoculado con staphylococcus epidermidis, el resultado es manitol - , el tercer tubo esta inoculado con staphylococcus aureus, la prueba es positiva pero no genera gas, este es un manitol +, el cuarto tubo esta inoculado con Escherichia coli, en esta caso la prueba es positiva y se ha generado gas que ha quedado atrapado en la campana de Durham (Tortora, Funke, & Case, 2007 )

Ureasa (Reacción de la Ureasa) Fundamento bioquímico Se fundamenta en determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar urea mediante la acción de la enzima ureasa. La ureasa es una amidasa, esta hidroliza los enlaces entre carbono y nitrógeno presentes en la urea, dando como productos dos moléculas de NH3 y liberando una molécula CO2. Las bacterias que poseen esta enzima pueden utilizar el nitrógeno de la urea. Esta enzima es importante para ciertas bacterias como Proteus spp, ya que está vinculada con la descomposición de materia orgánica. esta prueba es útil para diferenciar a familia de proteus, salmonella y shigella. (Bailón, Cruz, & Cervantes, 2003)

Procedimiento En la prueba bioquímica reacción de la ureasa se utiliza el medio de cultivo Agar Urea de Christensen, es un medio de tipo diferencia, nos va a permitir evidenciar si las bacterias sometidas a la prueba poseen la enzima ureasa y de carácter acido con pH de 6.8. El agar contiene peptona y glucosa, estos dos compuestos van a proporcionar el medio nutritivo a la bacteria para que se desarrolle, el NaCl se encargara de mantener el balance homeostático del medio, la urea es el sustrato de la ureasa y el rojo de fenol es el indicador de pH. El agar también contiene fosfato mono potásico. En este medio de agar al necesitar calentarse los componentes para preparar el agar, es recomendable no sobrecalentarlo ya que la urea se descompone fácilmente. La consistencia del medio es sólida y en forma de pico de flauta. Todo este medio se prepara en un tubo de ensayo. A continuación, se detalla un esquema del procedimiento. (Bailón, Cruz, & Cervantes, 2003) Agar solido en tubo de ensayo, en forma de pico de flauta

Preparacion del agar urea de Christensen segun las inidcaciones del fabricante

No sobrecalentar el agar.

Colocarlo en un tubo de ensayo de forma inclinada para forma el pico de flauta

Dejar solidificar

La siembra se lo hace a partir de un cultivo puro y con estriacion sobre la forma pico de flauta

Incubar a un atemperatura de 35-37ºC, y observar a las 8-12-2448 horas

Resultados Resultado positivo: se observa un resultado positivo cuando el color del agar ha cambiado de amarillo, a rojo roseas o fucsia. Esto revela que la bacteria posee la enzima ureasa, la cual ha hidrolizado la urea en 2 moléculas de NH3 y CO2, estos 2 productos alcalinizan el medio por lo cual el indicador de pH rojo de fenol vira el color de todo el agar a rojo rosado o fucsia. Si existe menos cantidad de productos el viraje de color se produce en menor cantidad. Hay bacterias que hidrolizan más lento a la urea por lo cual se produce un viraje de color más lento y necesitan un tiempo de incubación más prolongado (Elmer W. Koneman, 2008)

Resultado negativo: Un resultado negativo el indicador de pH rojo fenol no vira de color y el agar se mantiene de color amarillo, esto revela que la bacteria no utiliza la urea como fuente de nitrógeno. La gran capacidad buffer del medio de cultivo puede enmascarar la actividad de la enzima ureasa en bacterias que hidrolizan lentamente la urea como la klebsiela, enterobacter, y cianobacter, cuyo viraje de color se produce varios días después de la incubación. (Elmer W. Koneman, 2008) (Cavallini, Coronado, F.Chavarría, & Hidalgo, 2017) Visualización de los diferentes resultados en agar urea de Christensen

Ejemplos Tabla Nº2: ejemplos de bacterias positivas y negativas a la prueba de la ureasa Microrganismo Actividad ureasica P. mirabilis Positiva rápido k. neumonidae Positiva débil E. coli Negativa S. flexneri Negativa S. typhymurium Negativa

Resumen Las pruebas bioquímicas permiten determinar características metabólicas de las bacterias ya que mediante estas vamos a poder diferenciar especie, familia o genero de una bacteria, por lo cual este tipo de pruebas son de tipo diferencial. La fermentación de carbohidratos tiene como fundamento determinar la si una bacteria tiene la capacidad de fermentar un carbohidrato en particular. Importante en esta prueba son el uso del medio caldo rojo de fenol + hidrato de carbono y campana de Durham. Medio inicialmente rojo. Resultado positivo el medio se torna de color amarillo indicador de que le carbohidrato de ha fermentado. Colores como rojizo y naranja son resultado negativo. Principal ejemplo de bacteria fermentadora en la E. coli.

Reacción de la ureasa: determinar la capacidad de un organismo de desdoblar urea por acción de enzima ureasa. El medio de cultivo agar urea de Christensen, con una consistencia sólida y en pico de flauta. Medio inicialmente amarillo; un resultado positivo se evidencia un viraje de color de amarillo que revela que una bacteria utiliza la urea como fuente de nitrógeno a rojo rosado o fucsia de todo el medio y el resultado negativo el agar no cambia. Hay bacterias que demoran en hidrolizar la urea por lo que en este caso el viraje de color puede ocurrir de varios días de incubado el cultivo. Principal ejemplo de bacterias positivas e esta prueba es el proteus Ayuda nemotécnica

Preguntas ¿Cuál de los siguientes componentes no forma parte del medio de cultivo rojo de fenol? a) Peptonas b) Citrato de sodio c)Agua destilada d) Todas e) Ninguna ¿Qué idea pertenece al fundamento de la reacción de la ureasa? a) La enzima ureasa hidroliza la urea en dos moléculas de NH3. b) Determina la capacidad de un organismo de desdoblar amoniaco. c) La enzima ureasa media la unión de dos moléculas de NH3 para formar urea. d) Todas e) Ninguna

Determine cual afirmación es incorrecta. a) Para prepara el medio de cultivo para fermentación de carbohidratos y reacción de la ureasa se usa como indicador de pH al rojo de fenol. b) En el resultado positivo en la reacción de la ureasa el agar se torna de color rojo rosado intenso, mientras que en fermentación de carbohidratos se torna de color amarillo. c) La campana de Durham tiene como fin evidenciar la formación de gases en el medio de cultivo producto de a la fermentación. d) Todas e) Ninguna

Bibliografía Anónimo. (2011 ). Fermentación de Carbohidratos . Obtenido de http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/carbohidrat os.pdf Bailón, L., Cruz, R., & Cervantes, A. (2003). Universidad Autonoma de México. Obtenido de Atlas de Pruebas Bioquímicas para Identificar Bacterias : https://microbitos.files.wordpress.com/2010/06/atlasmicrobiologia1.pdf Cavallini, E., Coronado, M., F.Chavarría, & Hidalgo, J. (2017). Bacteriología General: Principios y Prácticas de laboratorio . San José-Costa Rica : Universidad de Costa Rica . Elmer W. Koneman, S. A. (2008). Koneman Diagnostico Microbiológico. Texto y Atlas a color . Buenos Aires-Argentina : Editorial Medica Panamericana . MacFaddin, J. F. (2003 ). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Buenos Aires-Argentina : Editorial Medica Panamericana . Olivas, E., & Alarcón, L. (2004 ). Manual de Prácticas de Microbiología básica y Microbiología de Alimentos. Universidad Autonoma de Ciudad de Juaréz. Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007 ). Introducción a la Microbiología . Buenos Aires-Argentina : Editorial Medica Panamericana ....