(7) Vettori Plasmidici Costruzione E Utilizzo PDF

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Botta e risposta. Domande di ingegneria genetica specifiche per il capitolo trattato. Utili per un veloce ripasso....

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Vettori Plasmidici: costruzione e utilizzo Dal clonaggio alla selezione dei cloni DNA frammento e vettore sono digeriti con lo stesso enzima di restrizione Ligazione dei due prodotti con T4 DNA ligasi Trasformazione delle cellule batteriche Selezione dei cloni postivi che hanno acquisito il plasmide ricombinante Caratterizzare i cloni positivi (sequenziamento, mappa di restrizione o PCR Quali plasmidi possono essere usati come vettori? Quelli piccoli, perché così sono più stabili (< 15 kbp) Che contengono siti unici di restrizione per ogni ER Che contengono uno o più marker genetici per la selezione Marker selezionabili più utilizzati? Sono i geni per la resistenza agli antibiotici: Procarioti: ampR, tetR, KanR Eucarioti: bleoR, KanR, IgBR e CamR

I plasmidi naturali sono dei buoni vettori? No. Non lo sono per cui sono stati creati dei vettori artificiali. Primo vettore plasmidico artificiale Il pBR322 creato da Bolivar e Rodriguez nel 1977 nell'università di Città del Messico.

pBR322 Quali erano gli obbiettivi da raggiungere e come è stato costruito pBR322? Un plasmide piccolo Doveva contenere dei siti di restrizione unici Doveva contenere due marcatori selezionabili Doveva avere un efficiente meccanismo di replicazione (elevato numero di copie) Nella costruzione di pBR322 come sono stati raggiunti questi obbiettivi? Con eventi di trasposizione Riarrangiamenti dei frammenti di DNA sia casuali che precisi Da quali plasmidi naturali si è partiti? Plasmide R1 contenente il Tn3 che porta la resistenza all'ampicillina Plasmide R65 che trasporta la resistenza alla tetraciclina Dal pMB1 che porta il meccanismo di replicazione di ColE1

Quali passaggi sono stati eseguiti nell'asemblaggio del pBR322? Costruzione di pSF2124. Per trasposizione da R1 (contenente il Tn3 è stata trasferita l'ampR a un plasmide ColE1. Ciò è stato eseguito co-coltivando i due ceppi e selezionando una variante che fosse ampR e col+.

Costruzione di pMB9. Si sono fatti dei riarrangiamenti del R65, il quale possiede una replicazione basata sugli interoni. In pratica, è stata fatta una frammentazione idrodinamica ed è stato selezionato un plasmide con tetR e capace di replicarsi autonomamente. Così si è ottenuto il pSF101. Il pSC101 è stato unito con pMB1 per trasferire l'ori di questo plasmide. Così si è ottenuto il pMB9.

In particolare, come si è ottenuto pMB9? In pratica, pSC101 e pMB8 (derivante dal pMB1 sono stati digeriti con EcoRI. I frammenti sono stati rilegati ed è stato selezionato un plasmide che portasse tetR e fosse immune dalla colicina.

Costruzione pBR313. Sono stati co-coltivati pSF2124 e pMB9 ed è stato selezionato un plasmide che fosse ampR e tetR. Da qui in poi si

sono cominciati dei riarrangiamenti con ER.

Quali siti di restrizione conteneva pBR313? 3 siti PstI 6 siti EcoRI Come si arriva da pBR313 a pBR322? Tagliando pBR313 con PstI si ottiene un plasmide tetR e ampS e colR. Mentre tagliando pBR313 con EcoRII si ottiene un plasmide con tetS e ampR e col-. Il primo plasmide viene tagliato con PstI e HpaI e il secondo plasmide viene tagliato con PstI e HincII. La ligazione dei due frammenti si ottiene con la formazione del sito PstI e l'unione delle estremità nette (non producono nessun sito per ER. Si seleziona un plasmide con tetR, ampR e col+.

Quali sono i siti di restrizione utili in pBR322? PstI nell'ampR BamHI nella tetR EcoRI tra la resistenza all'amp e quella alla tet Dove si inserisce il gene da clonare in pBR322? Si inserisce nel sito BamHI, il che porta a una inattivazione inserzionale del gene per la resistenza alla tet. Mappa pBR322 dettagliata

Come viene creato un vettore ricombinante? Vettore viene digerito con endonucleasi di restrizione X. Successivamente, si esegue un trattamento con fosfatasi alcalina, la quale rimuove i gruppi 5'P. In questo modo il vettore non potrà ricircolarizzare.

Frammento di DNA da clonare viene trattato con endonucleasi di restrizione X. Il vettore e il frammento digeriti vengono messi insieme con la T4 DNA ligasi. La ligasi unirà due delle quattro incisure. Il vettore con due incisure sarà abbatanza stabile da affrontare la trasformazione. Nell'ospite tramite la replicazione le incisure verranno riparate. Come funziona il clonaggio con pBR322? pBR322 viene digerito con BamHI. Il frammento di DNA viene digerito con BamHI. Si fa avvenire la ligazione con la T4 DNA ligasi. A questo punto potranno esserci diverse opzioni:  Il vettore è vuoto  Il vettore contiene più copie del frammento di DNA (legato testa-coda)  Il vettore contiene l'inserto La condizione ottimale è quella in cui il vettore ricombinante contiene una sola copia dell'inserto. Si effettua la trasformazione in E. coli Si esegue la prima selezione su piastre amp + LB (terreno ricco): per identificare l'acquisizione del plasmide Si esegue una seconda selezione su piastre tet + LB per identificare i cloni che hanno l'inserto nel gene per la tetR (presenza dell'inserto) L'inserto può essere presente anche sottoforma di più copie testa-coda. Sulla piastra tet crescono solo le cellule che hanno il plasmide vuoto (cloni negativi). Doppia selezione Con pBR322 vi è bisogno della doppia selezione e quindi di una coltivazione in replica. Le cellule trasformate vengono prima piastrate su amp+LB e poi, tramite l'utilizzo di un tampone di velluto sterile, su tet+LB. Le cellule che non crescono su tet+LB, ma crescono su amp+LB sono i

cloni positivi. Una volta raccolti i cloni dalla piastra amp+LB questi vanno amplificati in terreno liquido e caratterizzati. Come avviene l'amplificazione dei cloni? Si recupera il clone positivo dalla piatra ampRLB e si introduce in 1 ml di terreno liquido ampRLB. Dopo 1216 ore si otterranano 25X10^9 cellule. Caratterizzazione dei cloni positivi Sequenziamento Mappa di restrizione PCR Cos'è l'LB e cosa contiene? È il Luria Broth. Esso contiene Triptone (fonte di aa), Estratti di lievito (vitamine e elementi) e NaCl.

Vantaggi e svantaggi di pBR322 Vantaggi: Primo vettore plasmidico per il clonaggio. Ispirazione per i vettori successivi Con il pBR322 sono state studiate la trascrizione e la traduzione in E. coli, che sono servite per la caratterizzazione dei promotori procariotici. Quindi, ha fornito le basi per la costruzione dei vettori d'espressione. Svantaggi: Un unico sito di restrizione che non permetteva il clonaggio orientato Dimensioni ridotte non permettevano il clonaggio di dicreti frammenti di DNA Cosa è stato ricavato dall'operone del lattosio? Il frammento lacZ' (frammento alfa), il quale consta di 380bp e comprende: CAP, operatore, promotore e 146 aa del N-ter della beta-galattosidasi. Organizzazione dell'operone lac

Perchè è importante il frammento lacZ'? Perchè è in grado di complementare una mutazion lacZdeltaM15 di alcuni ceppi mutanti di E. coli. Perchè non è stato isolato e impiegato tutto il frammento lacZ? Per via delle grosse dimensioni (~ 1 kbp). Dove è stato utilizzato il frammento lacZ' per la prima volta? Nei vettori su base M13. Si stava cercando di assemblare i primi vettori d'espresssione. lacZ' in M13 I ricercatori hanno introdotto lacZ' in M13. Così facendo hanno creato M13mp1. Successivamente hanno inserito un sito EcoRI all'interno di lacZ' M13mp2. Tramite il sito EcoRi è stato inserito un poli-linker che portava diversi siti per ER M13mp7. Il sistema M13mp ha una selezione e permette l'espressione. Viene utilizzato ancora oggi. Schema

Cosa è derivato dalla serie M13mp? Il vettore pUC18. Questo aveva delle importanti caratteristiche: Stabile, grazie alle ridotte dimensioni MCS, permetteva un clonaggio orientato Selezione per alfa-complementazione (lacZ' e promotore) Alto numero di copie Schema

Mappa dettagliata di pUC18

Alfa-complementazione È la complementazione da parte del frammento alfa della mutazione lacZdeltaM15. La beta-galattosidasi funziona come un tetramero composto da 4 subunità di 1024 aa ciascuna. La mutazione M15 di alcuni ceppi di E. coli non permette di produrre una beta-gal funzionante (mancano aa da 11 a 41 nell'N-ter). Il frammento prodotto dai ceppi M15 viene detto frammentoo omega. Solo se viene fornito il frammento alfa con il plasmide si può ottenere una beta-gal attiva nei ceppi M15. Infatti, il frammento alfa fa da ponte tra due subunità omega. Schema

Che sostanze sono utilizzate per la selezione attraverso alfacomplementazione? IPTG analogo non fermentabile del lattosio, funge da induttore gratuito (inattiva lacI Schema

X-gal: composto cromogeno che quando scisso dalla beta-gal produce una colorazione blu Schema

Perchè IPTG è un induttore "gratuito"? Perchè induce la sintesi della beta-gal ma non viene tagliato da essa (al contrario dell'allolattosio) Selezione Bianco/Blu Avviene con pUC18. Il gene clonato all'interno dell'MCS va a rompere il frame di lettura di lacZ'. Se lacZ' non è funzionante in presenza di IPTG e X gal si avranno colonie bianche. Se il vettore invece resta vuoto allora il frame di lettura di lacZ' sarà intatto e quindi le colonie saranno blu. Il saggio può essere fatto dopo aver trasformato ceppi di E. coli con lacZdeltaM15 (su F' o sul cromosoma) con pUC18 ricombinante e aver piastrato queste cellule trasformate su LB+amp.

Selezione con amp permette di identificare i ceppi che hanno acquisito il plasmide Selezione bianco/blu permette l'identificazione dei plasmidi che trasportano il plasmide con l'inserto Falsi negativi e falsi positivi con Bianco/Blu Falsi negativi: il gene inserito è troppo piccolo e quindi la complementazione avviene lo stesso (colonie blu, ma ricombinanti) Falsi positivi: possono essere introdotte delle mutazioni durante le diverse generazione nel lacZ' tali per cui non avvenga la complementazione (bianche, ma non ricombinanti) Differenze selezione tra pBR322 e pUC18 In pBR322 era necessaria la doppia selezione In pUC18 è necessaria solo la selezione su amp con IPTG e X-gal

Perchè i cloni positivi vanno sempre caratterizzati?

Perhcè possono contenere l'inserto (situazione auspicabile) o più copie dell'inserto testa-coda (situazione da evitare) Che cos'è la trasformazione? È la capacità di acquisire materiale genetico dall'ambiente esterno da parte di un organismo. Con quali esperimenti si è identificato il fenomeno della trasformazione? Con quelli condotti da Mandel e Higa: questi notarono che se E. coli veniva trattato con CaCl2 e riscaldato velocemente questo diventava competente per l'acquisizione di materiale genetico di lambda 1970. Come si misura la competenza? Numero di trasformanti/ug di DNA. Metodi di trasformazione più utilizzati Chimico CaCl2 Fisico Elettroporazione) Come viene svolta la trasformazione chimica? Le cellule coltivate in terreno liquido vengono centrifugate Il pellet viene risospeso in una soluzione contenente CaCl2 in ghiaccio Tutto può essere immagazzinato a 80°C Dallo stock a 80°C si raccoglie un aliquota e questa viene messa in ghiaccio Si aggiunge il DNA plasmdico Si effettua uno shock termico portando la soluzione a 42°C Si piastra su LB+amp

Che resa si ottiene con la trasformazione chimica? 10^610^8 trasformanti/ug DNA. In che modo funziona la trasformazione chimica? Si pensa che i cationi positivi del Ca schermino il DNA La combinazione di bassa T e Ca cristallizza regioni della membrana permettendo l'accesso nei pori del materiale genetico

Elettroporazione Viene svolta tramite l'elettroporatore. Le cellule e il materiale genetico vengono poste in una soluzione salina dentro una cuvetta di 0.4 cm. La cuvetta è particolare perchè contiene due elettrodi per il passaggio della corrente. In pratica, si forniscono alle cellule dei micro-impulsi capaci di creare nella membrana dei pori transienti per l'introduzione di materiale genetico esterno. L'ampiezza e la durata degli impulsi variano per ogni tipo cellulare.

Che resa si ottiene con l'elettroporazione? 10^810^10 trasformanti/ug DNA....