Appunti - lezione 12 ottobre 2015 -voltage clamp e proprietà elettriche passive del neurone - fisiologia II - prof. Santillo - a.a. 2015/2016 PDF

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FISIOLOGIAII 12-10-2015 Sbobinatura di Mara Iasevoli e Federica Svizzero Prof. Santillo

Argomenti trattati nella lezione precedente: -concetto di overshoot , eccedenza, inversione di polarità di membrana; -concetto di soglia; -concetto di stimolo sovraliminare; -legge del ‘tutto o nulla’; -concetto di refrattarietà; -varie fasi del potenziale d’azione con l’avvio del ciclo di Hodgkin.

Tecnica del blocco del voltaggio Questa tecnica ha permesso di studiare le correnti alla base del potenziale d’azione utilizzando l’assone gigante di calamaro, caratterizzato da un diametro molto grande. Utilizzando elettrodi metallici, e non microelettrodi in vetro, che venivano infilati nella fibra ed elettrodi all’esterno della membrana fu possibile studiare anche le variazioni della conduttanza. La tecnica del voltaggio consente di bloccare il voltaggio di membrana su un determinato valore e spostarlo al valore scelto dallo sperimentatore. Abbiamo una doppia coppia di elettrodi: una coppia è collegata al voltmetro che misura l’effettivo valore di potenziale e un’altra coppia di elettrodi che è collegata con un generatore di corrente. L’apparato è organizzato in maniera tale che lo sperimentatore sceglie un valore di potenziale x al quale vuole bloccare la membrana e l’apparato in ogni istante va a misurare la differenza tra il valore di potenziale di membrana reale Vm e il valore Vx, potenziale di riferimento. Questa differenza determina l’erogazione di corrente da parte dell’altra coppia di elettrodi collegata al generatore di corrente, proporzionale alla distanza di Vm da Vx in modo tale da mantenere il voltaggio bloccato a Vx. La corrente erogata dall’apparecchio sarà uguale di intensità ma di verso opposto alle correnti ioniche che fluiscono attraverso la membrana. IMMAGINE PAGINA 29 CIRO CARLO Il blocco del voltaggio (voltage-clamp ) è stato applicato anche sulla singola cellula: la membrana viene portata ad un potenziale fisso prestabilito con una coppia di elettrodi collegata ad un generatore di corrente e la seconda coppia serve a misurare il potenziale di membrana Vm. Il dispositivo confronta continuamente il potenziale di comando Vcl con il potenziale di membrana ed eroga una corrente tale da mantenere il potenziale di membrana al valore di Vcl. Quando blocchiamo il potenziale ad un certo valore abbiamo inizialmente una corrente capacitativa che serve a caricare o scaricare la membrana determinando una variazione dell’accumulo di cariche a cavallo della membrana e tutta la corrente che andremo a registrare sarà la corrente ionica. La variazione di Vm è istantanea, la corrente capacitativa durerà per un tempo brevissimo e da quel momento verrà registrata solo la corrente ionica di intensità uguale e verso opposto alla corrente erogata. Applichiamo un gradino di voltaggio (portiamo il valore del potenziale di membrana dal suo valore iniziale ad un valore desiderato in maniera istantanea) e in maniera altrettanto istantanea il potenziale viene riportato al valore di riposo. In questo caso l’insorgenza del potenziale d’azione è bloccato perché il potenziale viene mantenuto fisso ad un determinato valore.

Se il voltaggio viene portato ad un valore inferiore al valore soglia per l’innesco del potenziale d’azione, registreremo una corrente costante tranne per un picco iniziale e finale (corrente capacitativa). Se applichiamo un gradino di voltaggio nel senso dell’iperpolarizzazione, passerà attraverso la membrana una corrente costante per tutto il tempo di applicazione del gradino di voltaggio: i flussi ionici netti variano, avranno una certa intensità proporzionale all’intensità del gradino di voltaggio applicato. Se portiamo Vm da -60mV a 0mV, superando il valore soglia, la registrazione delle correnti cambia notevolmente: avremo correnti dovute all’apertura dei canali voltaggio-dipendenti prima del Na e poi del K. Si registra prima una corrente ionica entrante (Na), poi questa corrente si annulla e successivamente, nella terza fase, avremo una corrente uscente (K). All’epoca degli esperimenti sul calamaro gigante, per capire quali fossero le sostanze coinvolte, si utilizzò la tetradotossina ( TTX) che blocca i canali del Na voltaggio-dipendenti e il tetraetilammonio (TEA) che blocca i canali del K voltaggiodipendenti. La corrente del Na si sviluppa, raggiunge un picco e poi decade, i canali si aprono, poi si inattivano. Il comportamento del K è diverso: la corrente del K aumenta con la depolarizzazione, poi raggiunge un valore stabile e si mantiene stabile finché la membrana è bloccata ad una valore di potenziale superiore alla soglia, non è dunque soggetto a inattivazione. IMMAGINE PAG 30 CIRO CARLO 

Registrazione corrente singolo canale con la tecnica del patch clamp.

Impostiamo un potenziale di comando e osserviamo le due configurazioni: cell-attached, che ci consente di misurare la corrente del singolo canale e la whole-cell, che si consente di misurare le correnti complessive che attraversano tutta la membrana. Consideriamo un esperimento in cui si porta il voltaggio da un valore di riposo di -80mV a un valore di -40mV, superiore alla soglia. I singoli canali del Na si aprono e dopo un certo tempo il canale va incontro a inattivazione; viceversa, i canali del K, finché il potenziale è ‘clampato’ a -40mV, oscilla tra lo stato di apertura e di chiusura. IMMAGINE 1 PAG 31 CIRO CARLO 

Esperimenti a diverso valore di potenziale e misurazioni delle varie conduttanze di Na e K.

Equazione di Ohm modificata per le correnti ioniche: (per il potassio)

Ik=gk (Vm –Ek)

La corrente ionica è uguale alla conduttanza per la forza spingente, che è la differenza tra il valore del potenziale di membrana e il potenziale di equilibrio del K. Misurando il potenziale di membrana a diversi valori di voltaggio è possibile calcolare la conduttanza come rapporto tra corrente e forza spingente. La conduttanza al Na aumenta e poi si riduce in maniera proporzionale al gradino di corrente, mentre quella del K aumenta e si mantiene costante per tutto il tempo di applicazione del gradino di corrente. La conduttanza del Na, inoltre, aumenta prima della conduttanza al K, ha, dunque, una cinetica più rapida. IMMAGINE 2 PAGINA 31 CIRO CARLO: Variazione conduttanza al Na e al K in funzione del tempo. La conduttanza al Na si riduce perché c’è il fenomeno di inattivazione e perché la ripolarizzazione induce la chiusura

dei canali del Na; la conduttanza al K non si inattiva, ma si riduce man mano che la membrana si ripolarizza. Il picco del potenziale coincide con il picco della conduttanza al Na e la fase di iperpolarizzazione postuma è dovuta al fatto che la conduttanza al K è ancora elevata in questa fase e il potenziale si avvicina al valore del potenziale di equilibrio per il K.

potenziale dipende dall’intensità dello stimolo: se aumenta l’intensità dello stimolo depolarizzante, il raggiungimento della soglia per l’innesco del potenziale avviene prima. Possiamo stabilire una curva intensità-durata: se mettiamo in grafico l’intensità della corrente stimolante e il tempo necessario affinché la corrente stimolante porti il potenziale al valore soglia otteniamo una curva intensità-durata.

IMMAGINE 1 PAGINA 32 CIRO CARLO

IMMAGINE 2 PAGINA 32 CIRO CARLO

Questa diapositiva mette a confronto lo stato di apertura o di inattivazione dei canali del Na e del K con le varie fasi del potenziale d’azione. Per il canale del Na, il gate di attivazione è stato disegnato sul versante extracellulare, ma si tratta di una semplificazione, in quanto il gate si trova sul versante intracellulare ed è rappresentato dai quattro segmenti S6; anche il gate di inattivazione è rappresentato da un’ansa citoplasmatica. Il canale del K presenta invece solo un gate di attivazione, sul versante intracellulare. Nella condizione di riposo i due canali sono chiusi (FASE A). Nella fase di depolarizzazione rapida, si apre il gate di attivazione dei canali del Na, questo entra e inizia il ciclo di Hodgkin. Poche la cinetica dei canali del Na è più rapida di quella del K, in questa fase di depolarizzazione rapida i canali del K sono ancora chiusi e ciò consente alla membrana di depolarizzarsi. Nella fase C, i canali del Na vanno incontro ad inattivazione, il gate di inattivazione chiude l’accesso al canale e il Na non passa più. L’attivazione dei canali del K permette la ripolarizzazione. Nella fase di undershoot, di iperpolarizzazione postuma, i canali del Na sono ancora inattivati perché la cinetica di inattivazione è lenta ed è paragonabile alla cinetica di attivazione dei canali del K. Adesso la membra si è ripolarizzata e la porta di attivazione si chiude, mentre i canali del K a cinetica lenta sono ancora aperti. Il flusso di K iperpolarizza la membrana e si ritorna alla fase di riposo.

Si chiama reobase l’intensità minima di corrente che, applicata per un tempo infinto, porta al raggiungimento del valore soglia (applicazione per un tempo infinito); si chiama cronassia il tempo necessario affinché uno stimolo d’intensità doppia rispetto alla reobase porti al raggiungimento del valore soglia. Quando parliamo di stimolo liminare, cioè in grado di portare al valore soglia, dobbiamo considerare il tempo di applicazione dello stimolo: uno stimolo di bassa intensità applicato per un tempo molto breve potrebbe non essere sufficiente a scatenare il potenziale d’azione ed eccitare la nostra cellula.

Refrattarietà L’inattivazione dei canali del Na determina il periodo di refrattarietà assoluta, in cui nessuno stimolo, per quanto intenso, determina l’insorgenza del potenziale. I potenziali d’azione che insorgono subito dopo hanno un’ampiezza leggermente inferiore. Dopo un certo tempo si ripristina la normale ampiezza dell’overshoot del potenziale d’azione. Il periodo di refrattarietà assoluta dura per tutta la fase di depolarizzazione rapida, per tutta la fase di eccedenza e per buona parte della fase di ripolarizzazione. Nella prima fase di depolarizzazione rapida non può insorgere un potenziale di azione nonostante i canali del Na non siano ancora inattivati, ma si trovano in fase di attivazione massimale, quindi un nuovo stimolo non determinerà l’insorgenza di un nuovo potenziale. Nelle fasi successive la refrattarietà assoluta è dovuta al fenomeno dell’inattivazione. Nella fase di refrattarietà relativa abbiamo l’insorgenza dei potenziali d’azione caratterizzati da un picco minore perché buona parte dei canali del Na sono ancora inattivi e perché vi è una corrente del K iperpolarizzante: l’ampiezza dell’overshoot si riduce. Non si raggiunge il valore del picco che si ottiene con lo stimolo test.

Cronassia e reobase Quando si vuole misurare l’integrità di nervi periferici si posizionano degli elettrodi sulla cute in corrispondenza del tronco nervoso oggetto di studio, vengono effettuate delle stimolazioni e delle registrazioni. Tra i parametri studiati vi sono anche la cronassia e la reobase. Quando applichiamo una corrente depolarizzante, il raggiungimento della soglia con innesco del potenziale d’azione avviene con un certo ritardo, non istantaneamente. Questo ritardo con cui viene raggiunto il valore finale del

Gli elettrodi extracellulari vengono posti a contatto con la cute in corrispondenza dei nervi la cui integrità deve essere valutata e si applicano delle correnti. Avremo un anodo e un catodo; si applica la corrente. Avremo due circuiti: una corrente esterna che fluisce attraverso il liquido extracellulare (più vicino è l’elettrodo al nervo e minore sarà la corrente esterna) e una corrente interna, Vs, che attraversa la membrana e fluisce attraverso l’anodo e attraverso il catodo. Quando si applica una corrente stimolante che depolarizza la membrana, verrà raggiunto un valore soglia del potenziale di membrana e si innescherà un potenziale d’azione propagato. Tramite degli elettrodi posizionati a valle del catodo si può misurare la velocita di propagazione (potenziali evocati per valutare la velocità di conduzione delle fibre nervose).

Un concetto importante è che se noi applichiamo una corrente stimolante che va a depolarizzare la membrana a livello del catodo, noi avremo una corrispondente iperpolarizzazione al livello dell’anodo. La corrente che determina depolarizzazione al livello del catodo ha verso opposto all’anodo, ovvero il verso dell’iperpolarizzazione. Questo è importante perché l’elettrodo che va a registrare è sempre messo a valle del catodo. Se, infatti, volessimo misurare la velocità di propagazione, ponendo l’elettrodo registratore a monte del cadoto si rischierebbe il blocco della propagazione. Questo perchè il potenziale di azione che insorge al catodo, diretto in entrambi i versi, verrà bloccato dall’iperpolarizzazione della membrana al livello dell’anodo. La prof rispiega: noi abbiamo posto in corrispondenza del nervo periferico due elettrodi extracellulari. Con un generatore applichiamo una corrente che seguirà in parte

questo circuito e quindi nella fibra nervosa, in parte sarà dispersa. A livello del catodo negativo abbiamo una corrente depolarizzante. Convenzionalmente il verso delle cariche è quello delle cariche positive. Queste cariche positive andranno a depositarsi al di sotto della membrana e riducono la differenza di potenziale a cavallo della membrana. Se l’intensità della corrente è sufficiente, parte un potenziale di azione. A livello dell’anodo avremo il fenomeno opposto perché qui si accumuleranno cariche positive sul lato esterno della membrana. Le cariche positive sul lato interno tenderanno ad allontanarsi per repulsione. La membrana quindi si iperpolarizza. Quindi depolarizzazione al catodo e iperpolarizzazione all’anodo. Questo tipo di stimolazione ci consente di valutare l’eccitabilità del nervo: reobase, cronassia e tutta una serie di parametri che confrontati con altri parametri di riferimento sono informativi dell’eccitabilità. Possiamo anche andare a misurare la velocità di propagazione lungo una fibra. In che modo? Ponendo degli elettrodi registranti a valle del catodo. A monte del catodo, a livello dell’anodo troviamo un tratto di membrana iperpolarizzata, refrattaria all’insorgenza del potenziale di azione. C’è quindi il rischio che il potenziale di azione che insorge al catodo e si propaga in entrambe le direzioni, si blocchi.

La capacità dipende anche dalle caratteristiche geometriche del condensatore, nel nostro caso la membrana cellulare.

Circuito elettrico equivalente

Gm = G1 + G2 + G3….Gn

Molte delle proprietà passive della membrana si possono spiegare facendo ricorso a questo modello del circuito elettrico equivalente (circuito RC). Associamo le proprietà fisiche della membrana con elementi tipici di circuiti elettrici (resistenza, capacità, batteria etc). Possiamo con questo modello spiegarci alcuni fenomeni: ampiezza dei potenziali generati dalle correnti sinaptiche, la velocità di propagazione del potenziale di azione lungo le fibre nervose, gerarchia di scarica dei motoneuroni etc. La membrana plasmatici è costituita da un doppio strato fosfolipidico che, in assenza di canali ionici, è isolante Sappiamo infatti che gli ioni possono fluire attraverso i canali ionici ma non attraversare fisicamente il doppio strato fosfolipidico. I versanti exttracellulare e citoplasmatico della membrana sono bagnati da soluzioni elettrolitiche e sono sede di separazione di cariche elettriche. Possiamo assimilare questa struttura a quella di un condensatore piano. In un circuito elettrico: condensatore è costituito da due armature conduttrici, sede di separazione di cariche elettriche, separate da un mezzo isolante. Il condensatore è caratterizzato da un valore di capacità. La capacità è espressa come: C = ∆Q/ ∆V Ovvero,il rapporto tra la quantità di carica custodita sulle armature del condensatore e la differenza di potenziale. Una separazione di cariche genera una differenza di potenziale. Un condensatore con un’elevata capacità è un condensatore che per generare una certa differenza di potenziale avrà bisogno di una maggiore separazione di cariche. Un condensatore a bassa capacità è un condensatore dove piccole variazioni della carica custodita sulle armature produrranno grandi differenze di potenziale.

C = ε S/d Dipende da: costante dielettrica del mezzo isolante; dalla superficie delle armature; inversamente proporzionale allo spessore, ovvero la distanza tra le armature. Un altro componente da analizzare è la resistenza del circuito elettrico equivalente, posta in parallelo con la capacità. La membrana è perforata da canali ionici che si lasciano attraversare da correnti ioniche. I canali oppongono a queste correnti una certa resistenza al passaggio. Per cui, l’insieme dei canali ionici che noi troviamo all’interno della membrana li possiamo paragonare ad un resistore, dotato di un certo valore di resistenza. La resistenza è data dalla legge di Ohm : I = V/R I canali ionici sono disposti sulla membrana in parallelo tra loro. Secondo la teoria dei circuiti il reciproco della resistenza totale della membrana è dato dalla somma dei reciproci. Ovvero: 1/Rm = 1/R1 + 1/R2 + 1/R3….1/Rn Dover R1, R2, R3 fanno riferimento alle resistenze dei singoli canali ionici. La conduttanza è il reciproco della resistenza. Quindi la conduttanza totale di membrana è la somma delle conduttanze dei singoli canali ionici.

Entrando più nello specifico, dobbiamo differenziare le diverse specie ioniche più importanti: Na, K, Cl. Possiamo considerare separatamente le relative conduttanze. Per ogni specie ionica possiamo rappresentare l’insieme dei canali ionici tramite un elemento circuitale formato da una conduttanza posta in serie con una batteria, rappresentata dal potenziale di equilibrio dello ione Ei .

Quindi per ciascuna specie ionica è possibile rappresentare tutti i canali passivi della membrana e il gradiente di concentrazione a cavallo della membrana con un simbolo elettrico equivalente costituito da un conduttore e una batteria, che in pratica è proprio il potenziale di equilibrio dello ione. Conduttore e batteria sono posti in serie. Ricordiamo la legge di Ohm modificata per il flusso attraverso canali ionici I = g x (Vm – Ei) Quindi, il potenziale di equilibrio di uno ione rappresenta la forza elettromotrice di natura chimica e può essere rappresentata da una batteria nel nostro circuito elettrico equivalente.

Questa immagine è un modello un po’ più dettagliato del precedente modello di circuito elettrico equivalente. Vediamo: i tre modelli circuitali per K, Na e Cl costituiti da conduttanza e batteria. una capacità C rappresentata dal doppio strato fosfolipidico, sede di separazione di cariche. A questi noti elementi aggiungiamo un generatore di corrente, che è la pompa Na+ - K+ ATPasi. Questa pompa genera gradienti ionici a cavallo della membrana che consentono poi i flussi ionici attraverso le resistenze dei singoli canali. Possiamo ora, attraverso questo circuito equivalente di membrana, analizzare alcuni comportamenti del neurone. Parliamo quindi delle proprietà elettriche passive del neurone.

Proprietà elettriche passive del neurone Queste proprietà si basano proprio sull’esistenza di elementi quali la Rm, la Cm e la Ri (resistenza assiale intracellulare, considera i flussi di corrente all’interno della cellula). C’è differenza tra proprietà elettriche passive e attive del neurone. Se noi stimoliamo una cellula con una coppia di elettrodi possiamo ottenere, a seconda del verso della corrente, una iperpolarizzazione o una depolarizzazione. Se l’elettrodo positivo si trova all’esterno, avremo una iperpolarizzazione perché le cariche si accumulano sul versante extracellulare e abbandonano la membrana sul versante intracellulare. Si parla, in questo caso, di corrente diretta all’interno. La corrente segue il flusso delle cariche positive. Nota: NON confondere la corrente del generatore con una corrente IONICA. Ovviamente, una corrente ionica in ingresso è depolarizzante.

Se invertiamo la polarità degli elettrodi, la corrente sarà diretta all’esterno. Le cariche positive vanno a neutralizzare le cariche negative sul versante interno della me...