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BIOQUIMICA es una quiral?: cuando una y su imagen especular no son superponibles. todas las biomoleculas son quirales. En el caso de los sustituyentes en el C, si todos son distintos, es en cambio si hay dos sustituyentes iguales es aquiral. Los que estructuran a las son es decir, que el grupo amino...

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BIOQUIMICA

¿Qué es una molécula quiral?: cuando una molécula y su imagen especular no son superponibles. *casi todas las biomoleculas son quirales. En el caso de los sustituyentes en el C, si todos son distintos, es quiral; en cambio si hay dos sustituyentes iguales es aquiral. Los aminoácidos que estructuran a las proteínas son alfa-aminoácidos, es decir, que el grupo amino esta unido al carbono alfa. Los 20 aá naturales son isómeros L (existen L y D)  

Conformación: arreglo espacial de grupos en una molécula Configuración: ruptura y permutación de átomos en la molécula.

Clasificación de aminoácidos de acuerdo a sus grupos R 1) Grupo R no polar (o apolar) y alif ático (cadena simple, sin ciclos y/o anillos)       

Glicina Alanina Valina Metionina Leucina Isoleucina Prolina (¿): en la estructura 3ria hace que la cadena se pliegue (forma “codos”)

*al ser apolares son TODOS hidrof óbicos, en este grupo se incluye también la fenilalanina 2) Grupos R aromáticos Fenilalanina Tirosina: presenta un grupo OH, que lo hace mas hidrofilico.  Triptófano *sus anillos pueden absorber luz con una longitud de onda de 280 nm, y con un espectrofot ómetro podemos cuantificar la concentración de proteínas en una solución  

3) Grupos R polares no cargados 

Serina: tiene un grupo OH que lo hace parcialmente cargado

 

 

Treonina: tiene un grupo OH que lo hace parcialmente cargado Cisteina: forma enlaces disulfuro (S-S) debido a que tiene un grupo sulfidrilo, lo que permite estabilizar la estructura 3ria de las proteínas. Los enlaces S-S se forman en ambientes oxidativo. Asparagina Glutamina

*serina, treonina y tirosina presentan grupos OH que pueden ser fosforilados y participar en vías de señalización de la célula. 4) Grupos R polares, cargado positivo   

Lisina Arginina: en aá mas básico Histidina: se encuentra en el sitio activo y participa en la catálisis de algunas enzimas.

5) Grupos R polares, cargados negativo:   

Aspartato Glutamato Tienen un grupo carboxilo que pierde f ácilmente su H+, quedando como COO-

Zwitterion: Ion que presenta carga neta cero, pero que presenta dos cargas aisladas, una positiva y otra negativa. Se encuentran as í en estado cristalino o en solucion acuosa

pI (punto isoeléctrico): pH al cual el aminoácido tiene carga neta cero pK: pH al cual la fracción no ionizada del compuesto corresponde a 50% y el otro 50% esta ionizado. Enlaces covalentes: los más fuertes Interacciones no covalentes entre biomoleculas

 Puentes de hidrogeno (dipolo-dipolo) -entre grupos neutrales -entre grupos del enlace peptídico  

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Interacciones iónicas: atracciónrepulsión, típicamente involucran un grupo amino positivo y uno carboxilo negativo Interacciones hidrofobicas: en estado no agregado (agua rodeando a partículas individuales) es menos entropica y energéticamente menos favorable; pasa lo contrario en estado de agregación hidrofobica (agua rodeando a varias partículas) Interacciones Van der Waals: cuando las moléculas están muy cerca se repelen, cuando est án muy lejos no hay interacción, deben estar a un valor intermedio para producir los dipolos momentáneos que permitan la atracción.

*la orientación espacial con que se forme el enlace determina su firmeza. Proteínas Enlace peptídico: es parcialmente un enlace doble (resonancia), ya que los electrones no enlazantes del N pueden pasar a la parte C-N del enlace peptídico, formando un doble enlace inestable. El enlace peptídico es covalente y NO tiene libre giro Estructuras 

Estructura primaria: secuencia de aminoácidos unidos por enlace peptídico



Estructura secundaria: la secuenciase pliega gracias a los sustituyentes afines y cercanos entre si, que se unen mediante enlaces NO covalentes (principalmente puentes de H). Existen dos formas, la alfa hélice (donde los sustituyentes quedan mirando hacia afuera) y la lamina beta u hoja plegada.



Estructura terciaria: la cadena se pliega sobre si misma (estructura tridimensional 3D) por interacción NO covalentes (iónicas, puentes de H, hidrofobicas, Van der Waals) con sustituyentes lejanos. Un ejemplo de esta estructura es el sitio activo de las enzimas. Los enlaces disulfuro ayudan a afirmar esta estructura, especialmente en proteínas exportables de la célula. *el prion puede tener dos estructuras terciarias, una dañina y la otra NO



Estructura cuaternaria: dos o mas cadenas o subunidades polipeptídicas

- Toda información necesaria para el plegamiento de la prote ína esta en la estructura primaria, por tanto ésta especifica la estructura y la función. - Las proteínas se pliegan espontáneamente en su conformación nativa (es la estructura tridimensional o terciaria de una prote ína en condiciones fisiológicas, y la denaturación es la perdida de esta estructura) -Los enlaces disulfuro NO promueven el plegamiento de la proteína, es decir, al no haber enlaces S-S la prote ína se hace mas inestable y por tanto mas propensa a ”modelar su forma” pero no a cambiar su conformación, que viene dado por el plegamiento.

Cómo desnaturar una proteína         

Calor Microondas Radiación UV Agitaciones fuertes Jabón Solventes orgánicos Fuertes ácidos y bases Sales Metales pesados

Clasificación de proteínas 1) Por estructura    

Fibrilar- globular Monomérico- polimérico Simples-conjugadas Etc.

2) Por función:    

Estructural De reconocimiento Catalizadora Etc.

Proteínas fibrosas: queratina y colágeno

Proteínas globulares: hemoglobina, mioglobina Plegamiento de proteínas     

Promovido por efectos hidrofobicos: los sustituyentes tratan de aumentar su agregación hidrofobica (quedar unidos entre si, excluyendo al agua) Estabilizado por enlaces disulfuro No ocurre al azar algunas proteínas grandes pueden ser ayudadas por proteínas chaperonas las ventajas son la flexibilidad, funcionalidad, y la posibilidad de transportar proteínas parcialmente desplegadas a través de la membrana.

Proteína globular: transportador de oxigeno. Hemoglobina transporta oxigeno y mioglobina almacena oxigeno. La proteínas fibrosas est án compuestas por la misma estructura secundaria, mientras que las globulares no (por ejemplo cada subunidad de la Hb esta formada por laminas beta y alfa helices) PROTEINA FUNCIONA= PARTE PROTEICA (APO-PROTEINA) + PARTE NO PROTEICA

Proteína conjugada Mioglobina: parte proteica + grupo hemo (grupo prost ético) / lo mismo con la Hb *el grupo prostético ayuda a la función de la proteína * El oxigeno se une al grupo prostético Mioglobina (Mb): es un monómero formado en m ás de un 70% por una hélice alfa Hemoglobina (Hb): tiene cuatro subunidades, (dos subunidades idénticas son llamados protomeros, la Hb es un dimero de protomeros) dos alfa y dos beta. Es un heterotetramero, cada subunidad tiene su grupo hemo. Grupo Hemo: formado por cuatro grupos pirroles y un Fe+2 (ferroso, este estado de oxidación no se cambia durante la oxigenación de la Hb o Mb) central Arriba se une el oxigeno y abajo a la subunidad correspondiente. Se une a la subunidad por una histidina proximal F8. La unión de oxigeno induce un cambio conformacional, donde el Fe del grupo hemo se

vuelve “complanar” al interactuar con O2, y propaga el cambio a toda la molécula. Así, el estado oxigenado se llama relajado o R y el estado desoxigenado se llama tenso o T. Este cambio de forma de T a R requiere que al menos dos subunidades tengan oxigeno unido. La hemoglobina requiere mayor presión de oxigeno para saturarse (menos afinidad) en cambio la mioglobina se satura a una menor presión (mayor afinidad) La hemoglobina es una prote ína alostérica, es decir, que la uni ón de una molécula de oxigeno genera un cambio de conformación en las demás subunidades, haciéndolas afines para la unión de oxigeno. Ahora. El oxigeno no se une por enlaces a la Hb, esta solo lo alberga entre el Fe y una histidina. Interacciones alostéricas Ocurre cuando moléculas específicas se unen a una prote ína y modulan su actividad mediante cambios conformacionales en ella, esta molécula es llamada modulador o efector alost érico, que se une reversiblemente a un sitio diferente del sitio activo o funcional. (*?) El 2, 3 difosfoglicerato, el CO2 y protones son efectores alost éricos de la unión de oxigeno a la Hb. El 2, 3 difosfoglicerato es una molécula que estabiliza el estado T disminuyendo la afinidad de la Hb por el oxigeno, este se une a algunas cadenas laterales de las subunidades beta. La elevaci ón de este efector alostérico permite aumentar el suministro de oxigeno a los tejidos. En Hb La afinidad por oxigeno esta influenciada por el pH. El CO2 por ejemplo disminuye el pH, y mientras mas acido sea el medio mas oxigeno se libera, esto es debido a la reacción del CO2 con el agua, que da como formación bicarbonato y protones y estos últimos pueden hacer protonar varios aminoácidos de la Hb, tomando la conformación T; por su parte el bicarbonato reacciona con el grupo alfa-amino terminal y forma grupos carboaminos que también estabilizan la conformación T. El efecto alost érico de los protones y el CO2 es llamado EFECTO BOHR En los bebes la hemoglobina es mas af ín al oxigeno, debido a que tiene competir con la oxigenación de la madre. Su mayor afinidad se debe a que su Hb une menos fuerte el DPG. Mutaciones en genes de alfa o beta globina pueden causar enfermedades como:

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anemia falciforme: mutación en una subunidad beta-posición 6, donde se sustituye un glutamato por una valina, la cual ocupa el “bolsillo hidrofobito” que ocupa el DPG en la conformaci ón T. Las células cambian de forma y se hacen menos flexibles.

Homologo: que cumple la misma función, tiene una estructura terciaria parecida pero la primaria puede ser distinta Identidad: a nivel de la secuencia; el alineamiento de estas muestra a un porcentaje de los aminoácidos idénticos. Por ejemplo, al comprar las subunidades alfa y beta de la Hb con la unidad de Mb, se ve que al alinear las tres, coinciden en una parte con histidina todas en el mismo lugar. *cambios conservativos: cuando se sustituye un amino ácido por uno similar que no provoca mutación. Métodos de purificación y caracterización de proteínas ¿Cuál es la necesidad de aislar una proteína?   

Estudios estructurales Estudios funcionales Diseño de drogas

Proteínas recombinantes: son aquellas producidas en el laboratorio mediante ingenier ía genética en células distintas a las que se producen en la naturaleza, por ejemplo, insulina humana producida en E. coli. Mediante el uso de virus se entrega la información de la proteina recombinante al huesped para que el organismo exprese la proteina. Estrategia de purificación de proteínas Selección del tejido Homogenización: es necesario romper la celula para después extraer la proteinas, puede lograrse por centrifugación logrando asi distintas fracciones celulares  Clarificación-precipitación  Solubilización y purificación -captura -purificación de mediana pureza -purificación ultra pureza *es necesario un test para monitorear. Por ejemplo: detecci ón inmunológica o test funcional.  

Descripción

Después de seleccionar el tejido paso al periodo de homogenización, que consiste básicamente en romper la celula, formando una solución proteica llamada extracto crudo. Pueden haber distintas técnicas de homogenización, como el choque om ótico (poner la muestra en un medio hipotónico para que entre agua y provoque histolisis), el ultrasonido con el uso de sonicadores, congelamiento con N liquido y posterior molienda, prensa francesa, etc. Luego de esto el extracto crudo se somete al periodo de fraccionamiento para aislar las proteínas que se desean estudiar, estas se separan de acuerdo a propiedades como el tamaño, la carga, etc.; usando diferencias de solubilidad, pH, temperatura o concentración de sales. Algunos tratamientos de fraccionamiento celular son la centrifugación diferencial donde se hace rotar el tubo a distintas revoluciones por minuto para que vayan precipitando progresivamente las moléculas del extracto, vemos entonces:   

Precipitado 1 (velocidad baja): células, núcleos, citoesqueleto Precipitado 2 (velocidad media): mitocondrias, lisosomas, peroxisomas Precipitado 3 (velocidad alta): microsomas, otras vesículas pequeñas

Otro tipo de centrifugación es por gradiente de densidad, donde a la muestra se le incorpora una solución de sacarosa (o cloruro de cesio) de alta densidad (por tanto la muestra “flota”), después se centrifuga y las proteínas van a ir quedando en distintas bandas de acuerdo a su densidad de equilibrio con la solución. Las proteínas también pueden precipitar al agregarles sustancias como el sulfato de amonio. La etapa de fraccionamiento también se puede entender como la clarificación y precipitación de la muestra. (¿) Es necesario tener algunas consideraciones para mantener en condiciones óptimas la muestra de proteínas de acuerdo a los factores que pueden afectarla:      

Temperatura: evitar altas temperaturas, dejar la muestra en hielo Congelar-descongelar (no lo entendí) Denaturación física: no agitar, usar vortex vigorosamente, meclar sin producir burbujas. Efecto de dilución: mantener concentraciones mayores a 1 mg/ml Oxidación: se agregan ciertos moleculas Metales pesados: se agregan ciertas moleculas

 

Crecimiento de bacterias: usar soluciones esteriles, incluir antimicrobianos y/o congelar Proteasas: incluir inhibidores de proteasas.

Luego de esto viene la etapa de solubilización y purificación donde entran en juego t écnicas como la cromatograf ía, donde se coloca la muestra en un medio especialmente capacitado para separar sus componentes. Cromatografía de columna: ocupa la diferencia de propiedades de las proteínas como la carga, tamaño, afinidad de unión, etc. Ocupa un material sólido poroso (fase estacionaria) y la disolución de proteínas que junto a una solución tampón (fase móvil), va a lograr desplazarse a traves del material porozo y se separará pordiferencias de propiedades. Las proteínas se pueden separar en función de: 

Su carga (cromatografía de intercambio iónico): el soporte o matriz se carga positivamente (es llamado intercambiador aniónico) si es que se quiere hacer precipitar las partículas positivas de la muestra (porque las negativas se unir án a la matriz) o viceversa cuando la matriz es negativa (es llamado intercambiador catiónico)



Por su tamaño (cromatografía de exclusión)

-Cromatografía de filtración en gel (o Sephadex): las bolas de gel en la solución permiten que las partículas más peque ñas se introducen en el gel y descienden mas lentamente que las partículas más grandes, que no pudieron atravesar el gel y descienden mas rápido por el solvente restante (el que no es gel). 

Por su capacidad de unirse a un ligando especifico (cromatografía de afinidad): las bolas de gel est án recubiertas por un ligando por el que tiene afinidad alguna de las proteínas a aislar. Al pasar la mezcla a través de la columna esta prote ína es retenida en la superficie de las bolas, y las dem ás siguen de largo. Ahora, para soltar la proteína del ligando se suele aumentar la fuerza iónica del solvente o incluir en este el ligando soluble a alta concentración de forma que compita por la unión de la proteína con el que esta unido a las bolas de gel. Ejemplos son la afinidad antigeno-anticuerpo, en este caso en anticuerpo esta presente en el solvente.

*La actividad específica de una proteína aumenta con su grado de purificación. El orden de las cromatograf ías que aumentan el grado de purificación es:

-cromatografía de intercambio iónico -cromatografía de exclusión -cromatografía de afinidad Diálisis: es otra técnica de purificación donde se obtiene proteínas sin solutos de por medio, mediante la eliminación de sales, las cuales pasan por un gradiente positivo al medio liquido (tamp ón) y porque son mucho mas pequeñas. La muestra se coloca en una bolsa de diálisis. Electroforesis: es otra técnica de separación gracias a los puntos isoeléctrico de las proteínas, las proteínas migran por la acción de un campo eléctrico. No purifica grandes cantidades de prote ínas y frecuentemente las inactiva, pero es útil como método analítico ya que estima rápidamente el número de proteínas y el grado de pureza, el punto isoeléctrico y la masa molecular aproximada. Se hace generalmente en gel de poliacrilamida Se forman bandas horizontales en la placa con gel (las cuales se ven porque se ha teñido la muestra). Mientras menos numero de bandas hay mayor pureza en la muestra y mientras m ás gruesa cada banda es porque hay mayor cantidad de esa proteína. Las proteínas se separan por: carga eléctrica, tamaño y forma. Acción de algunas moléculas:  

Beta-mercaptoetanol: rompe los enlaces S-S tanto inter como intramoleculares mediante su reducción. SDS: compuesto con una larga cadena alif ática (forma miscelas) que deja las proteínas con carga negativa, provocando su desplegamiento

Determinación de la secuencia de proteínas   

Composición de aminoácidos: con HCl se disgregan todos los aá de la proteína, Determina el tipo y cantidad de todos los aá del polipéptido. Determinación del aá con el amino terminal: el 2, 3 dinitrofenil modifica el amino terminal Secuenciación de péptido

Proteínas con más de 100 aá:   

Fragmentar Secuenciar péptidos Ordenar secuencia

La fragmentación se hace con proteasas como tripsina, quimiotripsina, entre otros; que cortan la cadena donde encuentras los aá que le sean afines. Para ordenar la secuencia se corta la misma proteína pero con enzimas distintas, luego se comparan ambas secuencias y se ordenan.

______________________________________ Enzimas Cada reacción tiene su enzima especifica. El catalizador no reacciona, no se consume y puede realizar la reaccion inversa *El catalizador hace disminuir la pendiente de la reacción Entre el reactante y el producto existe una barrera energetica El catalizador reduce la energia de activacion pero no afecta ∆G (diferencia en la energia libre) ni la constante de equilibrio *la velocidad de reaccion tiene que ver con la barrera energetica *la reaccion inversa reduce la barrera energetica (¿) *la eneregia libre es la capacidad de realizar trabajo a presion y temperatura constante

Caracteristicas catalizadores: 

  

de

las

enzimas

que

las

diferencian

de

otros

Alto poder catalitico: es una medida de cuantas veces aumenta la velocidad con una reacción, es decir, la capacidad de acelerar la velocidad de reacción. Especificidad: por ejemplo las proteasas, que rompen enlaces SOLO para ciertos aá a lo largo de la cadena Actúan en condiciones “suaves” de temperatura, pH y presión Sufren regulación: activación e inhibición

Clasificación de enzimas según el tipo de reacción catalizada     

Oxidoreductasas: transferencia de electrones (iones hidruro o atomos de H) Transferasas: transferencia de grupos Hidrolasas: reacciones de hidrolisis (transferencia de grupos funcionales al agua) Liasas: adición de grupos a dobles enlaces o formación de dobes enlaces por remocion de grupos Isomerasas: transferencia de grupos dentro de la molecula, dando formas isomericas

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Ligasas: formación de enlaces C-C, C-S, C-O y C-N mediante reacciones de condensación acoplada a la ruptura de ATP.

Nomenclatura Ejemplo: ATP + glucosa------ADP + glucosa-6-fosfato Nombre no sistemático de la enzima que cataliza la reacción: hexoquinasa (hexo por el numero de átomos de carbono de la glucosa y quinasas son las que transfieren grupos P)...