Tema 3 bioquimica - Apuntes 3-1 PDF

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tema 3 del primer parcial de bioquimica
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TEMA 3: REPLICACIÓN DEL ADN TEMA 3A CONCEPTO Los seres vivos, a diferencia de los seres inanimados, necesitan mantener su DNA tanto en lo referente a cantidad como a su secuencia. Por ello, antes de que las células se dividan, el DNA tiene que replicarse. La replicación es el proceso mediante el cual, a partir de una molécula de DNA, progenitora o parental, se obtienen dos moléculas hijas de secuencia idéntica. Permite el paso de la información genética a la descendencia. La replicación se produce de forma coordinada con la división celular, fase S.

PROPIEDADES DE LA REPLICACIÓN Todas las células replican su material genético atendiendo a las siguientes propiedades: 

MECANISMOS POSTULADOS PARA LA REPLICACIÓN DEL ADN:

MODELO CONSERVATIVO: Cada hebra de DNA se copia simultáneamente. Una molécula de DNA es bicatenaria y da lugar a dos hebras hijas. Al final del proceso replicativo, las dos hebras del DNA parental se asocian entre sí y las dos hebras hijas también se asocian entre sí. Proponía que tras la replicación se mantenía la molécula original de ADN intacta, obteniéndose una molécula idéntica de ADN. MODELO DISPERSIVO: El resultado final son dos moléculas nuevas formadas por hebras en las que se mezclan fragmentos originales con fragmentos nuevos. Todo ello se mezcla al azar, es decir, no se conservan hebras originales ni se fabrican hebras nuevas, si no que aparecen ambas mezcladas. MODELO SEMICONSERVATIVO: Este es el mecanismo de replicación aceptado actualmente. Cada hebra de DNA actúa como molde para la síntesis de una nueva hebra hija de DNA. Se produce el apareamiento entre la hebra molde y la nueva hebra sintetizada recientemente, originándose entonces 2 moléculas de DNA bicatenario, cada una formada por una hebra parental y una hija. Se obtienen dos moléculas de ADN hijas, formadas ambas por una hebra original y una hebra nueva. Esta hebra nueva es la complementaria a la hebra original (formada por bases complementarias a la original).

Meselson y Stahl demostraron que el modelo válido era el semiconservativo: En 1958 Meselson y Stahl desarrollaron un experimento con la bacteria E.Coli, dos isótopos radiactivos N15 (isótopo pesado) y N14 (isótopo ligero), los cuales utilizaron para marcar los nucleótidos utilizados en la síntesis de DNA. Además, también se aprovecha la diferencia de densidad que aparece en las moléculas de DNA, según esté cargado con el N15 o con el N14 y mediante la ultracentrifugación en gradiente de ClCs. Con este experimento lo que se consigue

es demostrar que el proceso de replicación es semiconservativo.

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Es bidireccional:

La replicación empieza simultáneamente en las dos direcciones a partir de los orígenes de replicación. La replicación es bidireccional (en los dos sentidos) es todos los organismos, excepto en el DNA mitocondrial y en algunos bacteriófagos. Mitocondrial: Unidireccional con dos orígenes uno para cada hebra. Procariotas: con un solo origen. Eucariota: más de 30000 orígenes (multiorigen). La replicación no es un proceso que ocurra al azar. La replicación comienza en un punto que se denomina Origen de replicación, se caracteriza por ser un lugar con una secuencia particular de DNA, rica en Adenina y Timina, A y T se encuentran en mayor proporción que C y G. Esto se debe a los enlaces de H que hay entre dichas bases, ya que entre A=T hay un enlace doble y entre C -G hay un triple enlace, de forma que será más fácil abrir secuencias de A=T que de C -G. Además, éste es un sitio de interacción con proteínas iniciadoras, que van a interaccionar para facilitar la localización del origen de replicación, promueve la disociación del DNA y también reclutan proteínas que facilitan/favorecen el inicio de la replicación. La doble hélice se tiene que abrir para que cada hebra pueda actuar como molde exponiendo para ello sus bases nitrogenadas. Como consecuencia de la formación de la burbuja aparecen dos estructuras en los extremos de la burbuja llamados horquilla de replicación.

Según de va copiando el DNA la burbuja irá evolucionando. Como hay 2 horquillas de replicación, la replicación se puede hacer en las 2 direcciones. En procariotas hay un único origen de replicación, mientras que en eucariotas hay múltiples, permitiendo que el DNA se replique de forma más rápida.

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Semidiscontinua: La hebra molde se lee de 3’ -- 5’, mientras que la de síntesis de DNA a partir de la hebra molde se va a hacer en sentido 5’-- 3’. En las horquillas de replicación siempre hay una hebra que se sintetiza de forma continua en el mismo sentido en que se abre la horquilla de replicación, la llamada HEBRA CONDUCTORA, y la otra que se sintetiza en varios fragmentos (síntesis discontinua), los denominados FRAGMENTOS DE OKAZAKI y que se conoce como HEBRA SEGUIDORA O RETARDADA, ya que se sintetiza en sentido contrario al de la apertura de la horquilla. La hebra dirección 5’=>3’ se replica de forma continua, pero la hebra dirección 3’=>5’ tiene que ser rellenada por fragmentos para cambiarle el sentido (fragmentos de Okazaki).

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Simultanea:

Las dos hebras se sintetizan simultáneamente. Una hebra sintetiza em el sentido de la horquilla de replicación (hebra adelantada o hebra conductora) (Replicación Continua). La hebra en la que la síntesis se hace en el sentido opuesto en el que avanza la horquilla se denomina hebra retardada. En este caso la síntesis se hace en cortos fragmentos (fragmentos de Okazaki) de forma discontinua. Síntesis en dirección 5’=>3’

DNA POLIMERASAS: Actividad Polimerasa La actividad polimerasa es de 5’—3’ El mecanismo consiste en que el OH (hidroxilo) que se encuentra en posición 3’ de la cadena de DNA ataca formando un enlace fosfodiéster al fosfato Alpha del primer nucleótido. Este primer nucleótido establecerá otro enlace fosfodiéster a través de su OH en 3’ y el fosfato Alpha del segundo nucleótido. Y así sucesivamente. Requerimientos para la actividad polimerasa: dNTPs(nucleótidos), hebra molde, DNA polimerasa, Mg2+ y un primer o cebador que proporciona extremos hidroxilos 3’ libres sobre los que adicionar nuevos nucleótidos.

ESTRUCTURA ADN POLIMERASA: La DNA – Polimerasa, prácticamente todas tienen una actividad polimerasa 5’--3’, esto quiere decir que sintetizan DNA en sentido 5’--3’. La estructura de las ADNO polimerasas se asemeja a la de una mano derecha a medio cerrar. Por esta analogía los tres dominios que poseen se conocen como: palma, dedos y pulgar: Palma : A este dominio se une el hidroxilo 3’ libre y los desoxirribonucleósidos trifosfatos entrantes. Este dominio también es capaz de verificar si el apareamiento entre bases es correcto. Este dominio participa en la catálisis.

Dedos: También interacciona con los dNTPs entrantes y además participa también en la catálisis. La función más importante que tiene es la de encerrar/envolver los dNTPs entrante, permitiendo que los sustratos estén próximos y se pueda llevar a cabo la reacción. Pulgar: Este dominio no participa en la catálisis. Lo que hace es unirse al DNA y de esta manera favorece que el molde no se disocie de la enzima. Sin el molde no se puede llevar a cabo la replicación.

ACTIVIDAD EXONUCLEASA: Actividad correctora de pruebas “Proofreading” La ADN polimerasa tiene actividad exonucleasa, es decir, elimina los nucleótidos mal incorporados. Rompe los enlaces fosfodiéster hidrolizándolos. Al ser una exonucleasa hidroliza los nucleótidos que se encuentran en los extremos de la hebra. Por lo que si nos encontramos ante una hebra en sentido 3’—5’ (Actividad exonucleasa 3’—5’) puede hidrolizar el enlace fosfodiéster que se encuentra entre el penúltimo y el último nucleótido. En cambio, si la hebra está en sentido 5’—3’ (Actividad exonucleasa 5’—3’) hidroliza el enlace fosfodiéster entre el primer y el segundo nucleótido, NOS PERMITE ELIMINAR LOS CEBADORES. En el caso de eucariotas no existe enzimas DNA Polimerasa que tengan esta actividad exonucleasa 5’-- 3’, y por lo tanto, los cebadores son eliminados por medio de otras proteínas. En procariotas, sí existen DNA Polimerasa con esta actividad exonucleasa. En el momento en el que la enzima encuentra el error el DNA recién sintetizado que se encuentra en el centro polimerasa, abandona este centro y se va al centro exonucleasa, donde la actividad exonucleasa 3’-- 5’ rompe el enlace fosfodiéster entre el nucleótido mal apareado y el nucleótido al que estaba unido. Liberado ese nucleótido mal incorporado, el DNA del centro exonucleasa se destina al centro polimerasa para seguir la adición de nucleótidos. Antes de añadir un nuevo nucleótido la DNA polimerasa verifica si el último nucleótido añadido es correcto. Si no es correcto, elimina el nucleótido desapareado, hidroliza el enlace que acaba de formar y libera el nucleótido.

Tasa de error en la incorporación: 1/4.000 Tasa de error en la comprobación: 1/4.000 1/4000 x 1/4000 = 1/16,000.000 Un error cada 16 millones de bases. Aun así se requiere un sistema de reparación.

Algunas DNA polimerasas tienen también actividad exonucleasa 5’-- 3’ (DNA pol I de E. Coli) Permite eliminar los cebadores La DNA polimerasa I elimina el cebador de los fragmentos de Okazaki y rellena los espacios entre fragmentos de Okazaki. Utiliza actividad exonucleasa 5’ 3’ para eliminar cebador de RNA y actividad polimerasa 5’--3’ para rellenar los espacios.

DNA polimerasas en Procariotas: DNA pol I: Eliminar el cebador y corrección de pruebas. En células Procariotas la DNA polimerasa I no va a tener actividad polimerasa para rellenar los espacios (actividad primasa). DNA pol II: Reparación DNA pol III: Enzima principal de la replicación.

TEMA 3B ELEMENTOS QUE INTERVIENEN LA REPLICACIÓN PROCARIÓTICA ADN original: que servirá de molde para ser copiado. Helicasa: Proteínas que se encargan de la separación de las dos hebras de DNA, con la finalidad que las bases nitrogenadas de las hebras queden expuestas y puedan actuar como molde para la síntesis de una nueva hebra complementaria. Las subunidades que componen DN A -Helicasas se disponen formando un anillo, una estructura anular, que se une sólo a una de las hebras del DNA, no a las dos. La helicasa unida a una de las hebras del DNA comienza a romper las interacciones entre las dos hebras, puentes de H. Este proceso de romper los puentes de H requiere energía, energía que procede de la hidrólisis del ATP. Desde el origen de replicación

necesitamos 2 helicasas, una para cada horquilla de replicación. En cada horquilla de replicación se sitúa una helicasa que comienza a avanzar por el DNA, liberando las dos hebras y permitiendo que cada una de ellas actúe como molde, es decir que pueda replicarse. Adoptan una estructura de anillo de 6 subunidades. Una de las hebras pasa por el agujero central de la helicasa Topoisomerasas: responsables de desenrollar las hebras de doble hélice. Proteínas SSBP: mantienen abiertas las cadenas de ADN abiertas una vez que ha actuado la helicasa. Se tienen que unir a las hebras ya que si no los puentes de hidrógeno se volverían a formar antes de que comience la replicación ARN polimerasa (PRIMASA): fabrica los cebadores, pequeños fragmentos de ARN que sirven para iniciar la síntesis de ADN. ADN polimerasas: Son las responsables de la replicación. DNA pol I: Eliminar el cebador y corrección de pruebas. En células Procariotas la DNA polimerasa I no va a tener actividad polimerasa para rellenar los espacios (actividad primasa). ¿? DNA pol II: Reparación DNA pol III: Enzima principal de la replicación. ADN ligasa: Encargada de unir los fragmentos de ADN.

COMPOSICIÓN DE LA HOLOENZIMA DNA POLIMERASA III DNA pol III es la enzima principal de la replicación. Es una holoenzima formada de varias subunidades: En este complejo nos encontramos la principal DNA -Polimerasa de replicación en procariotas, que es la III. Es una holoenzima formada por varias subunidades, de forma que está constituida por tres actividades enzimáticas (ATPasa), dos actividades polimerasas 5´-- 3’ (dos centros de DNA - Polimerasa III) y un complejo denominado Complejo γ (gamma), que es el cargador de la abrazadera, el que va a cargar la abrazadera sobre la hebra de DNA. La actividad enzimática que reside en el cargador de la abrazadera es una ATPasa. El cargador de la abrazadera carga la abrazadera sobre la hebra molde de DNA, no sobre el DNA dúplex. Lo que hace este cargador es: Cuando el cargador de la abrazadera tiene ATP unido, tiene afinidad por la abrazadera y por lo tanto, la une. La abrazadera se une al cargador cuando éste está cargado de ATP. La consecuencia de esta unión es que la abrazadera se abre. La abrazadera abierta unida al cargador tiene que interaccionar con la hebra molde de DNA, ésta interacciona cuando se ha formado el cebador (corto fragmento de 5 -10 nucleótidos de RNA), ahí es cuando el cargador de la abrazadera interacciona con el híbrido de DNA molde -RNA cebador. Es el cargador el que interacciona con el hibrido, no la abrazadera, y como consecuencia de la interacción, lo que ocurre es que la abrazadera que está abierta (cuando se une al cargador se abre) rodea el híbrido de DNA molde -RNA cebador. La segunda consecuencia es que el cargador de la abrazadera, al colocar la abrazadera sobre el híbrido, se produce un cambio

conformacional que estimula la actividad ATPasa que porta, de forma que el ATP se hidroliza a ADP y Pi, de forma que en este momento tendremos ADP unido al cargador, por lo que suelta la abrazadera, ya que pierde la afinidad por ella, de forma que la abrazadera inmediatamente que el cargador la suelta se cierra. De esta manera la abrazadera queda colocada sobre el híbrido DNA - RNA. La función de la abrazadera es la de impedir que la enzima, la DNA -Polimerasa III se suelte de la hebra molde, en definitiva, lo que hace la abrazadera es aumentar la velocidad de síntesis, la procesividad, número de nucleótidos incorporados por la enzima durante el tiempo que permanece unida al molde. Además del complejo cargador de la abrazadera, tenemos dos unidades de la proteína T (Tau), proteína que nos permite a través de un ligador flexible conectar la actividad enzimática (cargador de la abrazadera), con los dos centros Polimerasa que posee la holoenzima. Esta conexión se hace a través de un ligador flexible, el cual permite que la holoenzima pueda girar, de forma que una de las actividades Polimerasa catalice la formación de la hebra adelantada y la otra Polimerasa, la formación de los fragmentos de Okazaki, que dará lugar a una hebra continua cuando se eliminen los cebadores y se unan todos estos fragmentos. Un solo holoenzima nos permite la síntesis de las dos hebras. Este modelo se da en procariotas.

ETAPAS DE LA REPLICACIÓN DEL DNA. Pasos del Inicio de la Replicación: 

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Reconocimiento del origen de replicación: El origen de la replicación, comienza en un punto concreto del cromosoma llamado OriC este es reconocido por las proteinas iniciadoras de DNA. ( en procariotas solo tengo uno, en eucariotas hay muchos) rico en secuencias AT. Es el sitio donde se empieza a desenrollar la doble hélice.(Foto) Apertura de la doble hebra: a través de las helicasas y topoisomerasas. Creación de la horquilla de replicación y estabilización del DNA: las proteínas SSBP impiden que la hebra molde se vuelva a unir. Todo esto forma las burbujas de replicación que se extienden a lo largo del cromosoma en sentidos contrarios. Síntesis de cebadores: a través de la primasas....