ATP Sintase - Resumo Bioquimica Basica II PDF

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resumo sobre atp sintase...

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25.11.15 ATP SINTASE Recordando: - A mitocôndria é uma organela com 2 membranas, a membrana externa protege a organela e tem algumas enzimas escoradas, e pode ser removida com tratamento com um detergente chamado digitonina. O processo que estamos estudando (fosforilação oxidativa) ocorre fundamentalmente na membrana interna, que também pode ser desmontada com tratamento com detergente ou outros, e dela extraímos diferentes complexos proteicos que catalisam reações parciais da respiração celular (I, II, III e IV). - O complexo V envolve a utilização de um gradiente elotroquímico de prótons (H+) resultando dessa atividade para a síntese de ATP. - Quando juntamos os complexos, o produto do complexo I é utilizado no complexo III (que é a coenzima Q reduzida), o produto do complexo III é utilizado no complexo IV, transferindo elétrons para o O2. Para ajudar na transferência de elétrons para o O2, o produto do complexo II que era a enzima succinato desidrogenase do complexo enzimático resultante do Ciclo de Krebs, também tem como substrato a coenzima Q e vai reduzi-la. - O processo de transferência de elétrons ocorre naturalmente do menor potencial de redução para o maior (a respiração ocorre porque o O2 tem o maior potencial de redução). - Todas as reações de I a IV ocorrem espontaneamente (como se fosse correr água de quem está mais alto para quem está mais baixo) - As vantagens de ter o O2 como aceptor final de elétron, são:    

Ele é ABUNDANTE e DISPONÍVEL (fácil de conseguir) Tem maior POTENCIAL de REDUÇÃO Ele é “constantemente” PRODUZIDO Ele é facilmente difundido para a membrana interna da mitocôndria, porque ele é um GÁS (ele é consumido na membrana interna da mitocôndria, mas diferente de outros substratos ele não precisa de transportadores, pois ele é um gás – a mitocôndria é impermeável a maioria das substancias, mas a um gás não).

- Constituindo o fio biológico, ao invés de ter apenas um tipo de metal para transferir os elétrons; há vários metais principalmente Fe e Cu, com Fe associado a S ou Fe associado a grupos de proteínas, e são eles que transferem os elétrons na cadeira respiratória de fato. Exemplo: 2Fe/2S; 4fe/4S; etc. OBS: Embora alguns grupos possam ter 4 Fe, eles só transportam um elétron, ou seja, apenas um desses átomos de Fe vai transportar elétrons. E eles só podem transportar outro elétron na medida que passarem o que estão transportando adiante. - O conjunto do grupamento associado a proteína, chamamos de citocromo, e dependendo do tipo de grupo de proteína vão ser chamados de citocromo a, b, c, etc. (existe por exemplo o grupo pirrol, se quando 4 pirróis + 1 Fe = um grupamento heme) - Podemos seguir o estado de oxidação – redução comparando-o quando absorve em certas regiões espectrofotômetro.

- Complexos I, III e IV ao conduzirem os elétrons eles proporcionam transporte de prótons de um lado a outro da membrana – translocação de H+ (para o espaço intermembranar). Esses prótons não saem para fora da mitocôndria porque é formado um gradiente, as cargas positivas ficam fora da membrana interna e menos cargas positivas do lado de dentro (considerado negativo). Ou seja, cria-se um potencial de membrana que está atraindo os prótons. - A energia que fica conservada a partir da transferência de elétrons da cadeia respiratória, fica concentrada em parte na forma de um gradiente ELETROQUIMICO de prótons (diferença de concentração da espécie química H+ e diferença de cargas). - Esse potencial eletroquímico de H+ fornece energia para a síntese de ATP através do complexo V. (Forma-se também um potencial químico ∆pH, pois dentro da mitocôndria é alcalino).

#Experimento 1 - Forneceremos NAD para a cadeia respiratória: - Isola a mitocôndria, põe num tubo de ensaio. Compra o NADH da “sigma”. Adiciona esse NADH na presença de O2; vai funcionar? Não funciona porque a membrana interna da mitocôndria é impermeável e o NAD precisa entrar porque ele funciona no citoplasma da mitocôndria. O mesmo se aplica para o ATP. Se queremos sintetizar ATP no tubo de ensaio e colocamos o substrato ADP+Pi, nada vai ocorrer, porque esse substrato é utilizado no interior da mitocôndria. - Naturalmente (in vivo), na membrana interna há um sistema que troca ADP por ATP. Ele é essencial já que por ser impermeável a membrana interna, deve haver um jeito de colocar o ADP (substrato) para dentro e o ATP (produto) que foi produzido internamente para fora. - O que se sabe é que esse trocador só funciona, tirando ATP e botando ADP para dentro, simultaneamente. Ou seja, se isolarmos a mitocôndria e colocamos o substrato ADP imaginando que o transportador vai levar ele para dentro, na verdade nada ocorre porque não tem ATP dentro para ele fazer a troca simultânea. - Isso torna complicado trabalhar com a mitocôndria no tubo. - Muito do que se descobriu sobre a mitocôndria foi retirando a membrana externa (apesar que em termos de barreira de permeabilidade não interfere em nada) com digitonina. Após a retirada dessa membrana externa, usava-se de um método físico para romper a membrana interna. - Dependendo de como ela era quebrada, ela se remiscelava em vesículas (se remiscelava porque as membranas são extremamente apolares e hidrofóbicas, e por isso se unem), que poderiam se formar com uma orientação INVERTIDA com relação a orientação que ela tinha quando era completa.

- Vesículas que se formam com orientação invertida: Inside-out. Vesículas que se formam com orientação normal são chamados de Inside-in. (há processos para aumentar a frequência das inside-out que vão ser uteis nos estudos do processo da respiração, síntese de ATP e etc. - A membrana possui marcadores naturais que são os compostos que estão ancorados nela, como por exemplo o complexo V, etc. - Uma vez invertida a membrana, o NAD já pode ser usado. Quem interage com ele agora está posicionado externamente. Usando o NAD quer dizer que está respirando e se respiram geram um gradiente de prótons. Os prótons agora, no caso, são transportados para dentro da vesícula. (E depois esse gradiente vai ser responsável pela síntese de ATP). # Experimento 2 Tem como haver síntese de ATP sem gradiente de H+ da cadeira respiratória? - Coloca a vesícula invertida na presença de ROTENONA e CIANETO (inibidores do complexo I e do complexo IV da cadeira respiratória, que além do complexo III, bombeiam H+ ajudando a formar o gradiente) e a partir daí, mesmo na presença de O2, eles não transferem elétrons para o O2. - A respiração foi inibida e dessa forma não forma gradiente de íons H+ no meio, sendo que há um translocador na membrana, então passado um tempo fica a mesma distribuição de H+ de um lado e do outro da membrana. - É adicionado então ADP+Pi e um tampão BÁSICO. Esse tampão vai consumir o H+ do lado de fora da vesícula, ficando um gradiente de H+ artificial (ainda tem H+ dentro). Resultado: ATP. - A síntese de ATP usa um gradiente eletroquímico de H+ que é produzido fisiologicamente pela respiração (durante o transporte de elétrons).

Fosforilação Oxidativa: resumo da sequência de eventos que resultam na fosforilação CADEIA RESPIRATÓRIA: transporte de elétrons e consumo de O2

GRADIENTE ELETROQUIMICO DE PROTONS (∆Ψ + ∆pH)

SINTESE DE ATP (atividade enzimática da FoF1 ATP-sintase ou FoF1 ATPase)

- Para medir quantos ATPs são formados por cada NAD que passa elétron para o O2, usa-se fosfato radioativo (32) Dá para quantificar quantos ATPs são formados quando um NAD é utilizado na C.R (é reduzido)

O quanto de NAD é reduzido dá para saber pelo espectrofotômetro, com o coeficiente de extinção molar do NAD (o mesmo para o O2) Verifica-se que 1 NAD → ≈ 3ATP 1 FAD → ≈ 2ATP

- A síntese de ATP é feita pela ATPsintase (complexo V) Lembrando que a síntese de ATP é decorrente da transferência de elétrons tanto do NAD para o complexo da cadeira respiratória, formando gradiente eletroquímico de H+, como pelo FAD que está escondido no complexo II ou análogo. - Analogia: Hidrelétrica: DDP (diferença de potencial) que vai resultar no escoamento → Energia Mecânica (rodar o gerador) → Energia elétrica Mitocôndria: Energia potencial (gradiente eletroquímico de prótons) → vai escoar o H+ por um tubo e vai rodar o gerador (ATPsintase) e ela vai poder sintetizar o ATP (energia química). - Normalmente, há muito H+ do lado de fora, e quando ele entra pela ATPsintase, ela usa essa energia para gerar ATP. -Numa situação em que há muito H+ do lado de dentro e pouco do lado de fora (o gradiente está invertido comparando com o usual), verifica-se que a enzima ao invés de produzir ATP, ela hidrolisa ele (ATP → ADP+Pi). Com isso chamam ela de ATPase, porque ela pode tanto hidrolisar quanto sintetizar ATP. - A ATPase é constituída basicamente de duas subunidades:

Essas duas subunidades podem se separar, por exemplo, quando expostas à baixas temperaturas.

- Quando elas se destacam o sistema perde a capacidade de sintetizar ATP; o subdomínio relacionado a síntese e hidrolise de ATP é o F1 (Quando na ausência do gradiente, ele passa a hidrolisar ATP). - Chamaram essas subunidades de F, corresponde a fator, que associava um inibidor: OLIGOMICINA e passaram a chamar o subdomínio da membrana de Fo (Foligomicina). A oligomicina entope Fo não deixando passar H+. - Quando descobriram depois o outro fator que se associava e dissociava, passaram a chamar um de Fo e o outro de F1. - Os dois subdomínios (um na membrana, o outro hidrossolúvel) tem papeis distintos; o Fo é capaz de tornar a membrana permeável a prótons; enquanto F1 era capaz de sintetizar ou hidrolisar ATP (ou seja, o centro ativo da enzima está localizado em F1). - Eles são constituídos por diferentes proteínas: F1  

Contem sítios catalíticos Formada por 5 proteínas distintas: 1. α: 55KDa 2. β: 52 KDa 3. γ: 31 KDa α3 β3 γ δ ε (em Escherichia coli = modelo) 4. δ: 19 KDa 5. ε: 12 KDa

 

Canal de prótons pela membrana Formada por, no mínimo, 3 proteínas distintas: 1. a – 30 KDa 2. b – 17 KDa a1b2c6-12 3. c – 8 KDa

Fo

# Subunidade a - 5 Segmentos transmembranicos (a1, a2, a3, a4, a5) com α hélice - A 4ª hélice é bastante conservada - Os aminoácidos de uma hélice são dispostos como uma escada em caracol -Todos os grupamentos R desses aminoácidos fazem ponte de H, menos a leucina. - A leucina estava impedindo o fluxo de elétrons. - Há entretanto um outro aminoácido – que também tem a característica de formar ponte de H, e que está na mesma altura da leucina, mas em um outro complexo proteico (subunidade c) e com isso o H+ vai para ele. - Quando a subunidade a transfere o próton para a subunidade c, há uma repulsão eletrostática e o aminoácido entra pela membrana e o aminoácido que está lá atrás vem para frente doar H+. Um pedaço da subunidade c – Asp, fica negativo, vai ser neutralizado quando pegar o H+. Se tem ... - Quando a subunidade c roda, a γ também roda e as “pernas” de γ rodam na parte de cima.

# Subunidade β - A subunidade β tem o sitio ativo de ATPase. Entao são 3 sitios ativos porque são 3 subunidades betas. OBS1: Fizeram um experimento em que pegaram o complexo e viraram de cabeça para baixo e construíram um mutante com “alças” de apoio.

- Na subunidade γ ligaram um filamento de acina com um fluoróforo. Quando puseram isso para HIDROLISAR ATP viram o filamento de actina rodar através de videografia. A hidrolise tem sentido de rotação oposto ao da síntese de ATP. (Para fazer a hidrolise, eles colocaram ATP no meio e na ausência de um gradiente eletroquímico).

- Mesmo sem a subunidade c, quando o complexo hidrolisa ATP, muda a conformação e o γ roda mesmo se mestar ligado. O eixo do γ está ali e pode rodar em função da atividade da enzima.

- Depois passaram para o sistema completo, com o filamento de actina agora ligado a subunidade c. Enquanto a hidrolise ocorria e a subunidade γ girava, a subunidade c girava também. Fisiologicamente se roda c, roda γ também.

OBS2: Fizeram um experimento onde:  

Colocaram ADP em grande quantidade, porque assim ele iria se ligar em alguém com baixa afinidade Colocaram ATP em baixa concentração, porque iria se ligar em alguém com alta afinidade, só que se colocassem ATP a enzima iria hidrolisar ele, por isso colocaram uma molécula de ATP modificada, trocando um O por N e dessa forma ela não conseguia mais hidrolisar.

# Subunidade γ - As “pernas” do γ batem internamente na cavidade oca αβ, quando c gira, girando γ por consequência, e com isso vai mudando a conformação dos sítios. - Mudando a conformação, cada subunidade β passa por três estágios diferentes: ALTA AFINIDADE, AFINIDADE MÉDIA E BAIXA AFINIDADE. A alta afinidade para conseguir sintetizar ATP; baixa afinidade para liberar o ATP e afinidade média para ligar ao ADP e depois sintetizar o ATP. Cada β passa por mudanças conformacionais que alteram sua afinidade e podem estar:   

Vazias: afinidade 0 → βE = empty βADP: fracamente ligado → βl = lowsely boundt (afinidade média) βATP: fortemente ligado → βt = tightly boundt (afinidade alta logo após sintetizar ATP)

- α ajuda ou atrapalha a subunidade β - A com ADP+Pi tem uma afinidade média, sintetizou ATP alta afinidade, perdeu afinidade liberou ATP. E retorna esse ciclo. -Cada subunidade está numa conformação diferente em relação a outra, em um estágio diferente. - Pegando por exemplo a β vazia; ao mudar a conformação ela adquire afinidade por ADP. E ao mudar a conformação ainda mais, sintetiza ATP e fica com ele fortemente ligado. Ao mudar a conformação libera o ATP (porque perde afinidade). - As subunidades estão mudando a conformação porque estão interagindo com a subunidade γ, que está interagindo diferentemente a cada estágio, a cada instante com diferentes subunidades.

EVENTOS SEQUENCIAIS

- Quem tem ADP+Pi sintetiza ATP. Quem não tem liga ADP e o outro solta. - A subunidade β e a não estão rodando, e sim mudando sua conformação. ?...