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Esperimento di Beadle e Tatum su Neurospora...

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BEADLE E TATUM: RICERCA DI MUTANTI NUTRIZIONALI IN NEUROSPORA -Neurospora crassa è un fungo aploide (n=7) le cui divisioni meiotiche avvengono dentro gli aschi, lungo l’asse longitudinale: ogni meiocita produce in ciascun asco una serie di otto ascospore ordinate linearmente (ottade), che costituiscono i prodotti della meiosi e della successiva mitosi postmeiotica. Lo studio condotto negli anni 40 da Beadle e Tatum, non solo chiarì il ruolo dei geni, ma dimostrò anche l’interazione dei geni nelle vie biosintetiche. Per prima cosa irradiarono Neurospora per produrre mutazioni e poi analizzarono le colture ottenute dalle ascospore alla ricerca di fenotipi mutanti interessanti, molti dei quali presentavano difetti del metabolismo. In particolare questi ceppi erano auxotrofici. Mentre la Neurospora di tipo selvatico potenzialmente può utilizzare la propria biochimica cellulare per sintetizzare tutti i componenti cellulari a partire da nutrienti inorganici e da una fonte di carbonio presente nel terreno di crescita. -Per prima cosa Beadle e Tatum confermarono che ogni mutazione che aveva originato l’auxotrofia era ereditata come una mutazione di un singolo gene perché, quando veniva incrociato con il tipo selvatico, ogni mutante dava progenie con un rapporto di 1:1. -Il loro secondo passo fu classificare la richiesta nutrizionale specifica di ogni auxotrofo. Alcuni ceppi mutanti crescevano solo in presenza di prolina, altri di metionina, altri di piridossina, di argnina e così via. Beadle e Tatum decisero di focalizzarsi sui mutanti auxotrofi per l’arginina. Scoprirono che le mutazioni auxotrofiche per l’arginina si trovavano in tre loci diversi su cromosomi indipendenti. Chiamiamo arg-1, arg2 e arg-3 questi tre geni. I mutanti arg-1 crescevano su un terreno addizionato con una qualsiasi delle altre sostanze, ornitina, citrullina o arginina. I mutanti arg-2 crescevano su un terreno contenente arginina o citrullina, ma non su un terreno con ornitina. Infine i mutanti arg-3 crescevano solo su terreno contenente arginina. Sulla base delle proprietà dei mutanti arg, Beadle e Tatum ipotizzarono la seguente via biosintetica in Neurospora: precursore – ornitina – citrullina - arginina. Secondo tale modello nei mutanti arg-1 manca l’enzima x, perciò essi non sono in grado di convertire il precursore in ornitina, ma possedendo i geni per gli altri enzimi, quindi sono in grado di produrre l’arginina se si fornisce loro ornitina o citrullina. -L’enzima difettivo provoca dunque un’interruzione in una certa via biosintetica, e tale fermo può essere aggirato se si fornisce alle cellule una qualsiasi sostanza che normalmente interviene nella via di sintesi dopo il punto di blocco. Questo modello fu inizialmente chiamato ipotesi un gene-un enzima (poi un polipeptide): i geni erano in qualche modo responsabili del funzionamento degli enzimi e apparentemente ogni gene controllava uno specifico enzima in una serie di passaggi metabolici interconnessi. -Si scoprì poi che tutte le proteine, enzimi e non sono codificate dai geni, i quali determinano la struttura fisica proteica, e di conseguenza la funzione. -Si ricordi che alcuni geni codificano RNA che non vengono tradotti in proteine in quanto hanno già una specifica funzione (RNA funzionali), come il tRNA e l’rRNA. TEST DI COMPLEMENTAZIONE Per comprendere se due mutazioni appartengono allo stesso gene, si può mappare ciascun allele mutante o si può usare un approccio più rapido, ovvero il test di complementazione. -In un organismo diploide, si esegue incrociando due individui omozigoti per differenti mutazioni recessive e si vede se la progenie è fenotipicamente di tipo selvatico oppure no. -Se la progenie presenta il fenotipo selvatico, allora le mutazioni si trovano in geni differenti perché i rispettivi alleli selvatici forniscono la funzione normale: le mutazioni si complementano. Se la progenie non presenta il fenotipo selvatico, allora le mutazioni recessive sono alleli dello stesso gene e manca un allele selvatico che permette di distinguere tra due differenti alleli mutanti di un gene. -La complementazione è la produzione del fenotipo selvatico che si verifica quando due genomi aploidi che portano due mutazioni recessive diverse si trovano nella medesima cellula. -Esempio: Campanula. Colore blu selvatico, tre mutanti bianchi 1,2,3. Incrocio:

bianco (1/2/3) x blu -> F1 blu -> F2 ¾ blu ¼ bianco (1/2/3) La condizione mutante è causata quindi da un allele recessivo -Per capire se gli alleli mutanti si trovano sullo stesso gene ci si chiede se essi si complementano, si incrociano quindi i mutanti fra loro e si vede quali non si complementano e danno il fenotipo bianco e quali si complementano dando il fenotipo blu selvatico. -A livello molecolare il pigmento blu della campanula è l’antocianina, sintetizzata a partire da precursori che non sono pigmenti e pertanto non assorbono specifiche lunghezze d’onda (bianco). Il blu è quindi il prodotto di una serie di reazioni e ogni tappa è catalizzata da uno specifico enzima, codificata da uno specifico gene. In un organismo aploide non si può condurre tale test facendo incroci; tuttavia, nei funghi esiste una fusione che determina la produzione di un eterocarionte. Quando si fondono due ceppi, i nuclei aploidi dei due ceppi si trovano nella stessa cellula, l’eterocarionte (=due nuclei diversi), che simula una condizione diploide. Supponendo che, in ceppi diversi, vi siano mutazioni in due geni distinti che conferiscono lo stesso fenotipo mutante e poi fondendo questi ceppi possiamo concludere che, poiché i prodotti genici sono sintetizzati nello stesso citoplasma, i due alleli di tipo selvatico possono esercitare il loro effetto dominante e cooperare in modo da produrre un eterocarionte con fenotipo selvatico. I due mutanti si complementano. WOLLMAN E JACOB: CONIUGAZIONE INTERROTTA IN E. COLI -Nel 1957 Wollman e Jacob studiarono la modalità di trasmissione dei geni dei batteri Hfr alle cellule Fdurante l’incrocio. Dopo aver mescolato i due genotipi, a intervalli fissi prelevarono dei campioni e li introdussero per alcuni secondi in un agitatore, al fine di separare le coppie di cellule in coniugazione: questa tecnica viene detta coniugazione interrotta. -I campioni furono poi piastrati su un terreno con streptomicina per eliminare le cellule del ceppo donatore Hfr, che avevano l’allele di suscettibilità a tale antibiotico. -Osservarono che: ogni allele del donatore compare per la prima volta nelle cellule riceventi F- dopo un intervallo di tempo ben preciso dall’inizio della coniugazione; gli alleli del donatore compaiono in una specifica sequenza e quelli trasferiti più tardi sono presenti in minor numero di cellule rispetto ai primi. -Conclusione: durante la coniugazione di cellule Hfr, il trasferimento del singolo filamento di DNA inizia da un punto preciso sul cromosoma, origine (O), e prosegue in maniera lineare e consecutiva. Oggi si sa che il punto O è il sito nel quale è inserito il plasmide F. quanto più un gene è lontano, tanto più tardi sarà trasferito alle cellule F- e il processo generalmente termina prima che i geni più lontani siano trasferiti, quindi tali geni saranno inclusi in un numero minore di extraconiuganti. -Le cellule F- extraconiuganti vengono convertite raramente in cellule Hfr o F+. Quando Wollman e Jacob lasciarono continuare la coniugazione di cellule Hfr x F+ per due ore prima di interromperla, trovarono che alcuni extraconiuganti si erano convertite in cellule Hfr: la parte di F che conferiva la capacità di comportarsi come donatore alla fine veniva trasmessa, ma con una frequenza molto bassa, quindi fu chiaro che il fattore F venisse trasferito come ultimo elemento del cromosoma lineare. Il cromosoma Hfr, originariamente circolare, srotola una copia di se stesso, che viene trasferita alla cellula F- in modo lineare, con il fattore F che entra per ultimo. -Grazie a questo esperimento, Wollman e Jacob capirono che il cromosoma Hfr era circolare; inoltre realizzarono che attraverso gli esperimenti di coniugazione interrotta era possibile mappare i geni usando il tempo impiegato per la trasmissione come misura della distanza cromosomica. CRICK E COLL.: IL CODICE A TRIPLETTE -La dimostrazione che un codone è una tripletta fu condotta dagli esperimenti del 1961 di Crick e colleghi, che usavano mutanti nel locus rII del fago T4, che cambiano la gamma degli ospiti del fago. Infatti, il fago T4 è normalmente in grado di crescere in due ceppi di E.coli, chiamate B e K.

-Fagi mutati possono crescere su un ceppo B ma non su K e le mutazioni furono indotte dalla proflavina, che si pensava producesse inserzioni o delezioni di una sola coppia di basi nel DNA. -Partendo da una determinata mutazione indotta dalla proflavina chiamata FCO, trovarono reverenti (tornati al fenotipo normale) in grado di crescere anche sul ceppo K, ma attraverso analisi genetiche videro che tali reverenti non erano perfettamente uguali al wild-type. Si scoprì che la soppressione del fenotipo mutante era stata indotta dalla presenza di una seconda mutazione in un sito differente da quello di FCO, ma nello stesso gene, che reprimeva l’espressione della mutazione originale FCO. -Se si assume che un gene è letto a partire da una sola estremità, allora l’inserzione o delezione originaria indotta dalla proflavina potrebbe dar luogo a una mutazione poiché essa interrompe il normale meccanismo di lettura secondo il quale il gruppo di basi viene letto come parola. Quindi una mutazione frameshift potrebbe dar luogo a una frase (messaggio genetico) per la maggior parte senza senso. -Il giusto modulo di lettura potrebbe essere ripristinato da un’inserzione o delezione compensatoria in un altro sito, lasciando solo un piccolo tratto nonsense. Se assumiamo che il fattore FCO è causato da un’inserzione, allora la mutazione successiva di soppressione deve essere una delezione perché solo così il modulo di lettura potrebbe essere ristabilito. -Assumendo che le parole del codice siano di tre lettere e siano lette in una direzione possiamo avere. 1.Messaggio wild-type: CAU CAU CAU CAU CAU 2.Messaggio rIIa: variato dalla mutazione frameshift, che varia le parole dopo l’inserzione: CAU ACA UCA UCA UCA U 3.Messaggio rIIarIIb: poche parole errate, modulo di lettura ristabilito: CAU ACA UC(DEL)U CAU CAU. La spiegazione funziona correttamente anche se si assume che la mutazione FCO originale sia una delezione e quella del soppressore sia un’inserzione. -È stato dimostrato che la combinazione di tre inserzioni o tre delezioni agisce per ripristinare un fenotipo wild-type e queste osservazioni fornirono la prima conferma sperimentale che un messaggio nel codice genetico consiste di tre nucleotidi in successione. JOSHUA ED ESTHER LEDERBERG: PIASTRAMENTO IN REPLICA PER DISCRIMINARE MUTAZIONI NEI BATTERI -L’esistenza di mutanti in una popolazione dimostrata direttamente prima della selezione fu possibile grazie alla tecnica di replica plating (piastratura delle repliche), sviluppata da Joshua ed Esther Lederberg nel 1952. -Una popolazione di batteri fu piastrata su un mezzo non selettivo (senza il fago) e da ciascuna cellula crebbe una colonia. Questa piastra fu chiamata piastra master, o copia originale. -Un panno di velluto sterile fu premuto leggermente sulla piastra master per raccogliere le cellule nei punti in cui vi era una colonia. In questo modo, sul velluto rimase una impronta della piastra. Il velluto fu poi posto sulla piastra di replica con il mezzo di selezione (fago T1). Premendo il velluto sulle piastre, le cellule attaccate al velluto furono inoculate sulle piastre di replica nelle stesse posizioni relative di quelle delle colonie sulla piastra master. -Come atteso, rare colonie mutanti e resistenti furono trovate sulle piastre di replica, ma le piastre di replica multipla mostrarono profili identici di colonie resistenti. Se le mutazioni fossero avvenute dopo l’esposizione agli agenti selettivi, i profili di ciascuna piastra sarebbero stati così casuali come le mutazioni stesse. Gli eventi mutazionali devono quindi essersi verificati prima dell’esposizione all’agente selettivo.

-Questo risultato conferma che la mutazione si verifica casualmente nel tempo, piuttosto che in risposta a un agente selettivo. -Autopoliploidia. Gli organismi possiedono più corredi derivano dalla stessa specie. I triploidi 3n sono generalmente autopoliploidi; si formano spontaneamente in natura ma possono anche essere costruito artificialmente incrociando un tetraploide con un diploide (gameti 2n+n). i triploidi sono di norma sterili a causa della mancanza di appaiamento degli omologhi alla meiosi. Si può verificare la situazione in cui il gamete prodotta abbia un numero intermedio fra il numero aploide e quello diploide (aneuploidia), ma questi gameti danno luogo a progenie non vitale. -Allopoliploidia. Una pianta allopoliploide è un ibrido fra due o più specie con una o più copie di ciascuno dei genomi di partenza. Il prototipo fu ottenuto nel 1928 da Karpechenko, che voleva creare un ibrido fertile che avesse le foglie del cavolo (Brassica) e le radici del rafano (Raphanus), perché questi erano gli organi più importanti dal punto di vista agricolo per ciascuna delle due specie. Entrambi hanno 18 cromosomi (n1=n2=9). Gli ibridi erano però sterili perché i cromosomi del cavolo differivano da quelli del rafano tanto da impedire l’appaiamento corretto e la normale segregazione meiotica, e quindi gli ibridi producevano gameti non funzionali. Alla fine una parte dell’ibrido produsse alcuni semi che produssero individui fertili con 36 cromosomi, formati per un raddoppiamento casuale spontaneo dei cromosomi in una parte dell’ibrido sterile, presumibilmente in un tessuto che alla fine era divenuto un fiore e le cui cellule erano andate incontro a meiosi. Negli animali si registrano meno casi di poliploidia rispetto alle piante. Platelminti, sanguisughe e crostacei di ambiente salmastro, che si riproducono per partenogenesi, presentano casi di poliploidia. Ceppi tri e tetraploidi di Drosophila sono stati prodotti artificialmente. Anche anuri, salamandre e lucertole possono essere poliploidi. La famiglia dei Salmonidae è un caso celebre di specie originatesi mediante un’antica poliploidizzazione. Sono state sviluppate ostriche triploidi che, non andando incontro allo stadio riproduttivo che provoca un sapore sgradevole, sono gustose durante tutto l’anno. Aneuploidia Individui il cui numero cromosomico differisce dal tipo selvatico solo per una parte del corredo cromosomico; il numero può essere maggiore o minore rispetto al wild-type. Nei diploidi 2n+1 è trisomico, 2n-1 è monosomico e 2n-2 è nullisomico. Negli aploidi n+1 è disomico. La causa della maggior parte dei casi di aneuploidia è la non-disgiunzione cromosomica durante la divisione cellulare. La disgiunzione è la normale segregazione dei cromosomi omologhi o dei cromatidi fratelli verso i poli cellulari durante la mitosi o la meiosi. Nel caso della mitosi può verificarsi durante lo sviluppo, dando luogo a porzioni aneuploidi del corpo (settori aneuploidi). La non-disgiunzione meiotica è più frequente e dà luogo a prodotti meiotici aneuploidi che generano discendenti nei quali l’intero organismo è aneuploide; i cromosomi possono segregare erroneamente alla prima (più probabile) o alla seconda divisone e in entrambi i casi producono gameti n-1 e n+1. Se un gamete n-1 è fecondato da un gamete n si forma uno zigote monosomico, mentre la fusione di un gamete n+1 forma uno zigote trisomico....