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Protide acides aminés...

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BMOL - PROTIDES Intro : Ce sont des molécules composées de C, H, N et O. ! Dans les protides ont va regrouper différentes molécules :! - les acides aminés ou amino-acides : unités structurales de base qui vont être liés pour former d’autres molécules en particulier des peptides (petit nombre d’a.a) ! Parmi eux on retrouve les oligopeptides (enchainement de 2 à 10 a.a) ainsi que des polypeptides (enchainement inférieur à 50 a.a).! Les molécules qui comportent plus de 50 a.a sont appelées protéines (polymères de plus de 50 a.a)! Elles sont présentent dans tous les organismes du vivant allant des bactéries aux organismes plus développées.! Elles sont très abondantes dans les cellules. ! Elles sont les premiers constituant des solubles après l’eau il y en a 10 fois plus que les glucides. ! Elles sont très diversifiées par rapport à leur fonction, certaines peuvent avoir une fonction structurale et d’autres dynamique. ! Elles sont également le support de la spécificité des espèces, cette spécifié est inscrite dans le génome de chaque organisme. ! I - Les acides aminés Il existe environ 300 a.a naturels, dont un jeu unique de 20 a.a composants les protéines. ! Le nombre de ces acides aminés et surtout leur ordre vont déterminer la conformation de la protéine et donc sa fonction. ! Les a.a sont des molécules organiques composées de CHNO et ont tous la même structure représentant deux structures fonctionnelles présentent sur le même carbone (dit alpha): ! - Un groupement carboxyle (COOH)! - Une amine primaire (NH2)!

Cependant leur différence se fait au niveau du radical (ou chaine latérale) et qui va définir l’acide aminé.! Le moyen le plus courant de les classer est en fonction de la polarité de la chaine latérale. !

BMOL - PROTIDES Certains vont avoir une chaine latérale relativement hydrophobe (apolaire), d’autres vont avoir une chaine latérale polaire pouvant être chargée ou non chargée à pH=7.! Les a.a ont un code à 3 lettres mais également un code à 1 lettre permettant une traduction plus simplifiée. ! a) Les acides aminés à chaine latérale apolaire

- La glycine, Gly, G :! Cet a.a ne comporte pas de chaine latérale mais un H, ce qui en fait le plus petit a.a!

- L’alanine, Ala, A :! Elle présente un groupement méthyle comme chaine latérale (CH3)!

- La Valine, Val, V :!

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- La leucine, Leu, L :!

- L’isoleucine, Ile, I :!

- la méthionine, Met, M :! Cet a.a présente un atome de souffre. !

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- La Proline, Pro, P :! Cet a.a possède une structure particulière car le carbone alpha et l’azote sont dans un cycle. !

- La phénylalanine, Phe, F :! Même structure que l’alanine mais possède un groupement phényle en plus. !

- Le tryptophane, Trp, W :!

BMOL - PROTIDES B) Les acides aminés à chaine latérale chargée à pH=7 Ces a.a vont être plus ou moins hydrophiles en fonction du pH, ils sont au nombre de 5 dont 2 portant une charge négative à ph=7,!

- L’acide aspartique, Asp, D !

- L’acide glutamique, Glu, E!

Ainsi que 3 autres chargés positivement :!

- Arginine, Arg, R !

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- Lysine, Lys, K!

- Histidine, His, H!

C) Les acides aminés à chaine latérale polaire non chargée à pH=7 Ils sont au nombre de 6, ils sont hydrophiles.!

- Cystéine, Cys, C :! Cet a.a porte un groupement thiol composé d’un atome de souffre !

BMOL - PROTIDES Deux cystéines peuvent s’associer par leur groupement thiol formant alors un pont disulfure : # # -S—S-! Cela est du à la réactivité du groupement thiol qui s’oxyde facilement. !

- Asparagine, Asn, N :!

- Glutamine, Gln, Q :!

BMOL - PROTIDES Ce sont des a.a dérivés aminés des Acide aspartique et glutamique! Les 3 a.a suivants portent tous un groupement hydroxyle sur leur chaine latérale : ! - Sérine, Ser, S :!

- Thréonine, Thr, T : !

- Tyrosine, Tyr, Y : dérivé oxydée de la phénylalanine!

BMOL - PROTIDES Parmi ces 20 a.a qui constituent ces protéines, on en trouve 8 qui sont dits indispensables ou essentiels. ! L, T, K, W, F, V, M, I! «!Le Très Lyrique Tristan Fait Vachement Méditer Iseult!» C’est-à-dire que l’homme ne peut pas les synthétisé (métabolisé), ils doivent être importés par l’alimentation. ! Il y en a deux di semi-essentiels (l’enfant ne les synthétisent pas en quantité suffisante il faut donc l’apporter par l’alimentation) ! —> H et R! D) Propriétés physiques! 1- Le pouvoir rotatoire! Le carbone 𝜶 des a.a (hormis la Glycine) est un carbone asymétrique permettant de dévier le plan de la lumière polarisée. ! L’a.a peut donc exister sous deux formes, deux stéréoisomères, non superposables, des isomères optiques, appelés énantiomères. ! ! On va donc pouvoir définir deux séries : D et L ainsi que leur pouvoir rotatoire (dextrogyre ou levrogyre)! Les a.a que l’on trouve dans les protéines appartiennent tous à la série L mais peuvent être dextrogyre ou levrogyre. ! Cependant les a.a de la série D peuvent être retrouvés naturellement, dans les parois cellulaires des bactéries, ou dans certains peptides à activité antibiotique. ! 2 - La solubilité dans l’eau! Ils sont solubles dans l’eau mais leur solubilité varie en fonction de leur chaine latérale. ! La solubilité dans les solvants organiques est faible et varie également en fonction de la chaine latérale, elle est de l’ordre de quelques milligrammes par litre.! 3- Absorption dans l’UV Les a.a n’absorbent pas dans le visible (400nm-700nm), les solutions d’a.a sont donc incolores. ! Il existe trois a.A qui vont absorbés dans l’UV : W, F et Y! Ils sont aromatiques, ils portent un cycle aromatique sur leur chaine latérale. ! Ces propriétés vont permettent de détecter ces a.a dans l’UV! Lambda(max)= 280nm est la longueur d’onde maximale des a.a aromatiques. !

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Figure 1 : Spectres d’absorption des acides aminés aromatiques. Ces a.a optiques vont permettent de détecter des protéines quand il n’y a pas d’autres molécules absorbant dans cette longueur d’onde.! E) Propriétés ioniques Un a.a libre à au moins deux groupements fonctionnels, portés par le carbone alpha. ! Certains a.a possèdent un troisième groupe fonctionnel sur leur chaine latérale.! % Ces acides aminés sont donc dits amphotères. ! Ces groupements fonctionnels peuvent se dissocier et vont être caractériser en fonction de leur constante de dissociation appelée pKa. ! Groupement carboxylique (COOH —> COO- + H+) : PkA Environ= à 2 —> pKa1! Amine (NH3+ —> NH2 + H+) : pKa environ= à 9 pKa2! a- Acide aminé à chaine latérale ne portant pas de groupe ionisable Le pH pour lequel l’a.A est de charge nulle est appelé pH électroneutralité (ou pH isoélectrique = pHi)! Ce pHi est définie comme le pH pour lequel la charge de l’a.a est électriquement nulle, il y électroneutralité. ! Pour suivre la dissociation d’un a.a, on réalise une courbe de titrage permettant de caractériser la forme de l’a.a.! On suit alors l’évolution du pH nous permettant de déterminer le point d’équivalence, c’est en ce point que l’acide aminé est sous forme zwitterion.! La valeur du pHi est imposée par les valeurs des pKa, qui est égale à la demi somme de pKa1 et pKa2. ! Au niveau du pKa, on a autant de forme cation/anion que de forme zwitterion. !

BMOL - PROTIDES ! Le pH est à peu près stable dans un intervalle de (pKa-1; pKa+1) permet de déterminer une zone tampon. ! Une solution tampon (ou solution tamponnée) est une solution dont le pH varie peu lorsqu’on ajoute de petites quantité de base ou de faible quantité d’acide mais également lorsqu’on dilue cette solution. ! Elles sont très utilisées en biologie. ! Le pH de la solution tampon est donné par une équation de HendersonHasselback : ! b- Acide aminé à chaine latérale portant une fonction acide Ici, un troisième groupe sur la chaine latérale est dissociable. ! Il est donc possible de préparer 3 solutions tampons différentes. ! b.1) Acide aminée à chaine latérale portant une fonction basique L’ordre des pKa impose l’ordre de dissociation des acides aminés. ! De part et d’autre du pHi, l’a.a existe entre deux formes ioniques diffèrentes.! Cela permet de prévoir le signe et l’intensité de la charge de l’a.A dans un milieu à un pH donné, aussi appelé état statistique. !

Plus l’on est éloigné du pHi plus l’intensité est importante et inversement. !

BMOL - PROTIDES F) Applications analytiques a) L’électrophorèse On utilise un support poreux solide (papier, cellulose, gels d’agarose ou de polyacrylemide, …) que l’on imbibe d’un tampon pH choisi.! L’électrophorèse c’est la migration des molécules sous l’effet d’un champ éléctrique continu. ! Les molécules vont migrer en fonction de leur charge soit vers la cathode soit vers l’anode. ! Etudes de différents a.a à pH 6:

Attention, les charges de l’électrophorèse ne sont pas comme dans une pile, car, ici, la cathode attire les cations et l’anode les anions.

On cherche d’abord le pHi à partir des pka

pKa 1

pKa 2

Ala

2,3

9,9

Asp

2

9,9

Lys

2,1

9,1

pKa 3

pHi

Charge à pH 6

1/2(2,3+9,9) = 6,1

≃0

3,65

1/2(2+3,65) = 2,8

-

10,5

1/2(9,1+10,5) = 9,8

+

—> Coloration à la ninhydrine (tous les a.a sont colorés en violet hormis la proline donnant une coloration jaune) Cette molécule sert plus généralement à révéler les empreintes digitales sur support poreux.

b) Chromatographie d’échanges d’ions! Cette technique repose sur la mise en place de la liasion ionique entre des molécules à séparer et des ligants immobilisés sur une matrice insoluble qui vont retenir et échanger avec les acides aminés chargés. ! Il existe différentes résines : certaines sont échangeuses d’ions, de cation et d’autres échangeuse d’anion. Ligants — COOCes groupements peuvent être fixés sur des billes de cellulose. Lorsque les acides aminés sont sous forme de chaîne (les uns après les autres) on appelle cela des peptides. !

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Figure 2 : Séparation de 3 acides aminés par chromatographie échangeuse de cations. Les Peptides Ce sont des molécules qui sont crées par les liaisons entre un certain nombre d’acides aminés qui sont liés de façon séquentielle . ! I - La liaison peptidique La liaison entre le groupement hydroxyle du groupement carbonyle et un hydrogène de la fonction amine amène à la formation d’une liaison peptidique avec libération d’une molécule d’eau. !

b) Les angles et les longueurs

a) Rotation possible de part et d’autre du Cα

c) Un caractère partiel de double liaison

Figure 3 : La liaison peptidique.

La convention d’écriture veut que les acides aminés s’écrivent de gauche à droite. ! Cette liaison peptidique est différente des autres liaisons car elle se caractérise par un mélange entre une liaison simple et une liaison double. ! La liaison peptidique permet de lier les acides aminés les uns après les autres. !

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! II - Détermination du pHi d’un peptide! Exemple d’un tripeptide : Asp—Ser—Lys! ! pKa1

pKa2

pKa3

Asp

2

9,9

3,65

Ser

2,2

9,2

Lys

2,1

9,1

10,5

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III - Détermination de la séquence d’un peptide La séquence est l’ordre d’enchainement des acides aminés dans un peptide. ! Cette détermination se fait en 4 étapes :! 1- Déterminer la composition en acide aminés : ! - Rupture des ponts disulfures par agents réducteurs! Ex : Le β-mercoptoéthanol !

- Hydrolyse acide totale ! Elle entraine la réduction des ponts disulfures ainsi que la rupture de toutes les liaisons et libère tous les acides aminés sauf le Tryptophane qui est détruit. ! HCl 6 mol.L-1 à 110°C pendant 24h.!

- Analyse qualitative et quantitative de l’hydrolysât! L’analyse permet une séparation des acides aminés notamment pour la Norvaline (dérivé linéaire de la Valine) et la Sacrosine (dérivé méthylé de glycine) qui sont des acides aminés peu courants non trouvés dans les protéines. ! !

Séparation de 21 acides aminés et standards internes (Norvaline et Sacrosine). 2- Fragmentation de la chaîne : ! (utilisation du bromure de cyanogène (BrCN) qui va rompre la liaison peptidique du coté C terminal (fonction carboxylique) de la Métionine)!

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- Méthode chimique! Ex: La Trypsine, coupe les fonctions carboxyliques des acides aminés basiques (Ala, Lys) sauf si ils sont suivis d’une Proline (Pro) :!

Ex: La chymotripsine, coupe au niveau de la fonction carboxylique des acides aminés (Phe, Tyr, Trp) sauf si ils sont suivis d’une Proline (Pro) :!

- Méthodes enzymatiques : endopeptidases! Ex: L’aminopeptidase, coupe l’acide aminé au niveau du N-terminal.! Ex: La carboxypeptidase, coupe l’acide aminé au niveau du C-terminal.!

3- Identification des aa terminaux :! - Méthodes enzymatiques : exopeptidases (fonctionne comme la méthode d’Edman)! - Méthode chimique d’Edman (utilisée dans des séquenceurs)!

BMOL - PROTIDES Méthode d’Edman (par dégradation récurrente) :!

4- Reconstitution de la séquence ! Les Protéines! Ce sont des macromolécules qui sont composées d’une ou plusieurs chaînes polypeptidiques. ! Ces chaines sont constituées d’acides aminés toujours liés entre eux par la liaison peptidique. ! Elles ont une structure tridimensionnelle qui est parfois complexe. ! On peut donc définir différents niveaux concernant la structure de ces protéines ! I - La structure primaire C’est l’ordre d’enchainement des acides aminé, la séquence. ! Cette chaine peut se replier localement et adopter différentes structures qui sont appelées structure secondaires.! II- La structure secondaire La structure secondaire est donc le repliement locale d’une portion de la chaine polypeptidique. ! On en distingue deux types : ! - L’hélice 𝛼 : portion de la chaine sous forme d’hélice présentant des liaisons hydrogènes se formant à partir des liaisons peptidiques. (H des liaisons peptidiques) !

Liaison ionique

Liaison hydrogène Pont disulfure

Interaction hydrophobe

Figure 5 : Les liaisons impliquées dans la structure spatiale.

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- Le feuillet β : ils impliquent deux feuillets de chaine face à face et antiparallèles ou parallèles. Antiparallèle

Parallèle Antiparallèle Parallèle

On parle également de conformation native qui définie l’activité biologique de la protéine. III -La structure tertiaire Exemple de la myoglobine, (protéine globulaire) présentant 8 hélices alpha et possédant 154 a.a Exemple de la fibroïne de la soie (protéine fibreuse) présentant une structure en feuillet β antiparallèles. Une caractériqtique importante de cette protéine est qu’elle est constitué de trois a.a qui sont relativement petits permettant une compacité (Ala; Gly; Ser) Exemple de l’hormone de croissance présentant des hélice 𝜶 ainsi que des feuillets β possédant 191 a.a. Pour le repliement dans l’espace des liaisons hydrogènes peuvent s’établir entre les liaisons peptidiques de a.a ainsi qu’entre les a.a chargés à pH7 = liaisons ioniques (ou liaisons faibles)(car milieu biologique tamponné aux alentours de pH7).

Il y a également possibilité d’interactions hydrophobes amenant les a.a apolaires au coeur de la molécule et les a.a hydrophile se retrouvent aux bords de la molécule permettant des interactions avec le milieu extérieur. Il peut y avoir présence de ponts disulfures (liaisons covalents) si la forme de la protéine s’y prète.

BMOL - PROTIDES IV- La structure quaternaire Toutes les protéines ne présente pas cette structure. Ce sont les protéines présentant une association avec une sous-unité pouvant avoir cette structure. (appelée aussi monomère) Exemple de la Miraculine ayant la capacité de modifier les gouts acides et amers en gout sucré. Cette protéine est un dimère (car composée de 2 sous unités) ou homodimère (2 x 192 a.a) Exemple de la Calcineurine présente deux sous-unité différents, on parle alors de hétérodimère (A= 521 a.a; B= 155 a.a) Exemple du Collagène, présentant une association de 3 chaînes, molécule la plus abondante dans le corps humain ayant un rôle structural.

Exemple de la Porine, protéine membranaire formant des pores, présentant 3 sous-unités (Trimère). Ces 3 sous-unités forment une structure en tonneau (structure super-secondaire) créant un canal afin de laisser passer des molécules.

Exemple de l’Hémoglobine présentant 4 sous-unités (Tétramère) : 𝛼 globine 141 a.a et β-globine 146 a.a....