Cellules souches peau - Notes de cours 1-5 PDF

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Jerome LAMARTINE - cours integral sur les cellules souches de la peau...

Description

Cellules souches de la peau I.

Le modèle cutané.

Caractéristiques : 2 m2 ; presque 10% de la masse corporelle ; épaisseur entre 1,5 et 4 mm. Rôles : protection ; régule les échanges hydriques / thermiques, régule le débit sanguin ; informative via des sensors mécaniques / thermiques / nocirécepteurs pour la douleur ; métabolisme (synthèse de la vitamine D en présence des UV → absorption des minéraux dans les reins/intestins). La peau est formée à partir de 2 feuillets : mésoderme et éctoderme. – Hypoderme : réserve énergétique (graisses) → effort intense et long ou déficiences en apport énergétique ; participe passivement à la thérmoisolation (graisses) – Derme : divisé en derme papillaire (haut) et derme réticulaire (bas). Le derme papillaire : l'épiderme fait des invaginations dans le derme → adhésion forte entre le derme et l'épiderme. Cellule majeure : fibroblaste. Riche en protéines matricielles : collagène et élastines. Contient aussi : des lymphocytes, des histiocytes ; des vaisseaux de la lymphe. – Jonction dermo-épidermique : assure des fonctions spécifiques. Anomalie : épidermolyse bulleuse.

– Epiderme : épaisseur variable due à la couche cornée, contient les mélanocytes (origine mésodermique → crête neurale), les cellules de Langerhans, cellules de Markel (rôle sensoriel). Les mélanocytes sont responsables de la synthèse de mélanine = pigment de la peau. Cellule majeure : kératinocyte. K5 et K14 : seulement dans l'épiderme et seulement dans la couche basale. Cette couche cellulaire est la seule qui prolifère. La couche épineuse : désmosomes qui assurent le lien entre les cellules. A partir de la couche épineuse on exprime K1 et K10. La couche granuleuse est la dernière à contenir un noyau. Contiennent des granules de kératohyaline et des corps lamellaires. Protéines : loricrine et filagrine → sécrétées (à partir de la couche de transition) pour fabriquer la structure qui entoure les kératinocytes = l'enveloppe cornée. Les corps lamellaires : sécrètent à l'extérieur les lipides et les sucres.

La couche cornée : par les cornéocytes. Plus d'organites, plus de noyau. Entre les cellules : des fibres de loricrine qui sont pontés (liaisons covalentes) par des transglutaminases. Les lipides se trouvent entre les cornéocytes. La différenciation est contrôlée, la durée de vie d'un kératinocytes = 28 jours (pour tous les stades). Cornéocyte = 14 jours. Puis libération et remplacement par nouvelles cellules etc. Follicule pileux : structure compliquée. Invagination de l'épiderme dans le derme. Les cycles sont très différents entre les follicules humains et les follicules des rongeurs (rongeurs : phase catagène très-très longue). Un poil a un cycle de vie spécifique : – Anagène : phase de croissance (3-6 ans) – Catagène : arrêt de la croissance, le bulbe dégénère (quelque semaines) – Télogène : dégénérescence, expulsion du cheveu Glande sébacée : produit le sébum pour lubrifier le poil. Mélange de lipides qui a plusieurs fonctions : lubrification ; production de film hydrolipidique de protection (agressions, antibactérienne). Glandes sudoripares : font partie des glandes exocrines, à l'origine de la transpiration. Deux types : eccrines et apocrines. Chez les rongeurs la couche de l'épiderme est beaucoup plus fine, on considère que la couche granuleuse est quasi-inexistante.

II. Les cellules souches dermiques/folliculaires (mésenchymateuses, SKPs, mélanocytaires). Fonctions des cellules souches avant la naissance : morphogenèse, organogenèse ; après la naissance : renouvellement physiologique des tissus et organes, régénération en cas de lésions ou blessures. Caractéristiques des cellules souches : – Petites cellules rares dans le tissu – Non différenciées – Quiescence ou faible activité mitotique – Fort potentiel de prolifération – Capacité de détoxification et réparations (lésions ADN) – Capacité d'autorenouvellement (long terme) – Capacité de générer le tissu ou l'organe auquel elles appartiennent – Pluripotence et plasticité Où on trouve des cellules souches dermiques/épithéliales : – Peau – Intestin

1.

Cellules souches cutanées non épidermiques.

→ Les MSCs : mesenchymal stem cells Les MSCs se différencient en 3 types de cellules (selon le milieu de culture) : – Doxometazone + insuline → adipocytes – Chondrocytes – Ostéocytes Aident la régénération de peau dans des protocoles de restitution tissulaire (grand brules, brulures importantes et profondes, brulures radiologiques [γ, X]). Effet d'irradiation de la peau : radioépitelite = comme coup de soleil ; hyperpigmentation ; fibrose ; carcinomes (baso-cellulaire ou spino-cellulaire). Destruction locale du tissu ; les antalgiques ne fonctionnent pas ; différentes phases (plus ou moins tardives). Greffe MSCs : permet de régénérer le tissu suite aux irradiations importantes. 1e patient était soigné par ce protocole (protocole complexe) : sujet irradié au Chili (soigné en France). Hypothèses : activer les cellules souches locales ; les cellules greffées vont se différencier et donner les cellules de la peau. On trouve les MSCs dans : peau abdominale ; peau mammaire ; chez les enfants : prépuce. On vérifie les marqueurs exprimés par ces cellules : on trouve les marqueurs spécifiques des cellules mésenchymateuses. On peut trouver des MSC (rare) au niveau des follicules pileux.

→ Les SKPs : skin derived precursors (non épidermiques) Identifiées lors de la recherche des cellules souches neuronales dans la peau. Forment des sphères (cellules issues des adultes ou des jeunes) comme les cellules souches neuronales ; expriment la Nestine. Au bout d'une semaine de différenciation expriment la β3 tubuline ; au bout de 21 jours de différenciation expriment des marqueurs spécifiques des neurones gabanergiques. Ces cellules peuvent régénérer les cellules gliales : astrocytes, oligodendrocytes, cellules de Schwann. Se trouvent dans le derme, expriment la fibronectine spécifique des cellules du mésenchyme. Selon le milieu : se différencient en muscle ou en adipocyte. Pour ne pas les confondre : les MSC ne poussent pas dans le milieu des SKP ; n'expriment pas les mêmes marqueurs (sauf fibronectine). Analyse clonale : les SKP peuvent s'autorenouveler à long terme (formation des sphères suite à la dissociation des cellules plusieurs mois après). Origine : dérivent de la crête neurale (structure transitoire) → les SKP et les NCSC expriment des marqueurs en commun. Localisation : au niveau de la papille dermique du follicule (nexin, versican, wnt5a). Les SKP sont utilisées en thérapie cellulaire : régénération de cellules de Schwann (pour la moelle épinière) ; régénération de myéline dans le système nerveux ; formation d'un lignage de type épidermique.

→ Les MSCs : melanocyte stem cells Renouvellement constant des mélanocytes pendant le cycle pilaire. Repeuplement des mélanocytes depuis le Bulge → greffe de la partie du cheveu qui le contient permet de restaurer le pool de mélanocytes → poil qui pousse est pigmenté. • Vitiligo : maladie de perte de pigmentation. La reprigemtation possible au niveau des poils sur les zones dépigmentées. • Perte de pigmentation des poils lors du vieillissement. • Mélanome : transformation tumorale des mélanocytes.

III. Les cellules souches épidermiques / kératinocytaires (CSKs). Changement des cellules suggère qu'il existe des cellules souches qui se différencient progressivement. 1.

Méthodes d'étude.

On étudie une caractéristique des cellules souches à la fois. Méthodes de localisation : → Identification des cellules quiescentes in vivo : – Label retaining cells : injection de Thy3 ou BrdU dans la queue de la souris → analyse des cellules marquées plusieurs jours, semaines après le marquage. LRCs = cellules quiescentes = cellules souches ? Possible d'utiliser un marquage non radioactif dans les souris transgéniques (système TET off). On met en évidence les CSKs dans : IFE (intrafollicular epidermis), Bulge. – Marquage ex vivo : on isole une cellule, on la marque et on la remet dans l'organisme. On va regarder si la cellule va donner de la descendance. Donne des colonnes de cellules qui sont de plus en plus différenciées (si une CSK). – Lineage tracing : cellules génétiquement modifiées. Avec une dose minimale de Tamoxifen on va marquer seulement quelques cellules isolées. On regarde si donne de la descendance qui sera aussi marquée. → Caractéristiques phénotypiques permettant de les purifier / enrichir : – Phénotypes basés sur l'expression de récepteurs membranaires – Phénotypes basés sur leur potentiel de détoxification → Tests fonctionnels : – Potentiel de prolifération : après la culture des cellules à très faible densité (poussent sur des feeders) on obtient 3 types de clones : holoclones ; meroclones ; paraclones. Si on obtient des holoclones → on avait des cellules souches à la base. – Potentiel de différenciation : on regarde l'organogenèse → reconstituer la peau in vitro (derme issu des biopsies / derme synthétisé à partir du collagène, glycosaminoglycanes et chitosan → on greffe les kératinocytes et on regarde si on obtient l'épiderme stratifié qui perdure dans le temps) ; greffe de cellules folliculaires chez la souris nude (génération des poils). On fait des xenogreffes iteratives (avec 2 receveurs) → prolifération et autorenouvellement.

2.

Localisation.

Les CSK (on présume qu'elles sont quiescentes) se localisent au niveau de l'épiderme intrafolliculaire et des cellules très quiescentes au niveau du Bulge du follicule. Expérience sur les vibrisses des rats : la seule région qui donne les 3 types de clones (holo/mero/para) se trouve au niveau de Bulge.

3.

Propriétés.

→ Culture à long terme : Dans la couche basale de l'épiderme humain on a une hétérogénéité proliférative entre les cellules : 20 passages ; 100 passages ; prolifération indéfinie. Hypothèse (Potten) : au niveau de la couche basale on a 3 types de cellules → queiescentes ; proliférantes ; post-mitotiques. Démontrée par modele EPU (epidermal proliferation unit). En théorie il suffit d'avoir des cellules proliférantes pour régénérer l'épiderme. Cela était démontré sur la queue de la souris (zone glabre), pas de démonstration sur la peau humaine. → Division asymétrique : On observe des mitoses dont l'orientation des cellules traduit leur devenir. S'observe au cours du développement mais pas après. Cela permet la stratification et la différenciation des cellules dans la peau des mammifères. Pas de démonstration d'autorenouvellement. Les cellules avec le potentiel clonogénique le plus important = cellules avec le potentiel reconstrsuctif le plus important. Travail sur le Bulge transplanté : les cellules du Bulge migrent et peuplent le follicule → on restaure les follicules pileux mais aussi fabriquent la glande sébacée et participent à la fabrication de l'épiderme interfolliculaire. Les cellules de Bulge dans certaines conditions peuvent donner les cellules des 3 feuillets primaires ; peuvent donner les progéniteur neuronaux (possèdent des marqueurs spécifiques) ; peuvent fabriquer des vaisseaux (in vitro).

4.

Marqueurs et méthodes d'isolement des CSKs.

– Kératines spécifiques : différents selon le stade de différenciation et de la localisation tissulaire et cellulaire. Kératines de l'épiderme : K1 et K10 (cellules apicales) ; K5 et K14 (cellules basales ; spécifiques des cellules de l'épiderme). Certaines kératines sont spécifiques des structures, comme les kératines du follicule pileux. Ex : K15 et K19 (potentiellement associées aux cellules souches) ; K19 marque le Bulge ; de plus les cellules qui expriment K19 sont enrichies en LRC (cellules quiescentes). – p63 : FT de la famille p53, l'homologue le plus proche c'est p73 ; le gène donne 6 protéines distinctes [isoformes] (épissage alternatif). Dans l'épiderme les formes les plus exprimées sont les

formes ∆N. Ce FT est nécessaire au bon développement de l'embryon, si déficient → pas d'épiderme ; pas de paupières ; pas de vibris ; hypoplasie des mâchoires etc. Expression dans la peau humaine : au niveau des cellules basales, au niveau du Bulge. p63 était longtemps associée aux kératinocytes immatures → certaines auteurs ont utilisé p63 pour montrer l'utilisation des cellules souches. En réalité : marqueur des cellules proliférantes. Rôle : régule la prolifération et la différenciation des kératinocytes de la couche basale ; régule la stratifine = 14-3-3σ (transduction de signal, rôle de 14-3-3σ dans la différenciation). – c-Myc : un autre FT qui agit avec Max ; dans la peau exprimé dans la couche basale et dans le Bulge ; exprimé dans les cellules proliférantes et indifférenciées. Hypothèse : Myc stimule la prolifération et diminue la différenciation ; or la surexpression de Myc induit une baisse de prolifération et une stimulation de la différenciation → rôle plus complexe dans le devenir des cellules souches. En réalité : Myc permet de sortir les cellules souches de leur état quiescent. Démonstration sur les souris transgéniques ; si surexpression dans l'épiderme → la glande sébacée est trop développée ; hyperplasie de l'épiderme interfolliculaire. Le KO de Myc dans la couche basale : épiderme plus mince, différenciation prématurée (les progéniteur ne prolifèrent plus, donc les cellules souches vont compenser la disparition de ce tissu et vont se différencier). – La voie Wnt/β-cat : le ligand Wnt lie son Rc membranaire → séquestration des inhibiteurs de β-cat → β-cat agit comme FT. Rôle important pour les cellules souches du follicule pileux. La nature de cellules qui reçoivent cette signalisation et l'intensité du signal définit l'effet de la voie Wnt sur les CSF.

→ Comment isoler les cellules souches avec les marqueurs ? Il faut au moins savoir enrichir une population en cellules souches. On se base sur : Rc spécifiques et potentiel de détoxification. Il n'existe pas de marqueurs ultimes ; on utilise souvent les intégrines. – Intégrines : différents complexes des chaines α et β. Les cellules qui ont la capacité d'adhésion très très importante → cellules immatures potentiellement souches. – Rc de transferine CD71 : marqueur utilisé en synergie avec l'adhésion pour enrichissement de la population en cellules souches. Les chercheurs ont regardé s'il y a des cellules qui expriment différemment ce Rc. Faible expression = cellules en état de quiescence. Ces deux marqueurs sont beaucoup utilisés par les laboratoires, notamment pour isolement / enrichissement en cellules souches humaines. Principe de marquage Hoechst : potentiel de détoxification. La population « side » élimine progressivement le marquage → on perd la population lors de l'analyse par FACS. Test fonctionnel / méthode « SP » : potentiel profilerait des kératinocytes en culture. Les cellules ne perdent pas le potentiel prolifératif dans les cultures à long terme. On regarde la capacité de reconstruire l'épiderme et le derme au bout d'un certain nombre de passages.

5.

Signature moléculaire ou le transcriptôme des cellules CSKs.

Cette approche était assez décevante. Etude de Lrig dans les épithéliums : régulateur de la quiescence (positif), si déficit = pas de quiescence et les cellules prolifèrent. Etude de Lrig et Myc : la surexpression de Lrig provoque la diminution de Myc.

6.

Utilisation des CSKs.

– Applications cliniques : traitement des grands brules ; correction de maladies génétiques – Application industrielle : tests in vitro (effets 2nd ; effets irritants) → Traitement des grands brûlés : Urgence vitale de remplacer la barrière pour empêcher l'entrée de pathogènes et surtout limiter la déshydratation. On réalise la greffe de peau autologue : on prélève l'épiderme dans une zone non brûlée pour la placer sur la lésion de brulure. Si pas assez de peau saine : utilisation des substituants cutanés. On réalise alors des greffes allogéniques ou xénogéniques ; c'est temporaire ou définitif. Greffes de la peau de porc : l'animal dont la peau a la structure la plus proche de celui de l'homme. Dans d'autres pays utilisation de la peau de poisson. Première culture de kératinocytes : 1975. Rapidement le processus s'épand et de plus en plus de chercheurs le font. Le mécanisme s'améliore aussi. La prise de greffe dépend de la présence de cellules souches qui vont régénérer le tissu. Peau totale reconstruite : pour la recherche. On utilise plutôt un derme mort pour les greffes (plus de cellules, contient que des fibres, sera recolonisé par les fibroblastes des patients).

→ Correction des maladies génétiques : Surtout pour les maladies les plus graves comme les épidermolyses bulleuses (problème au niveau de la jonction dérmo-épidermiques). Les individus sont sujets à des cancers de la peau (accumulation des défauts génétiques). Traitement : transplantation des cellules souches génétiquement modifiées afin de traiter l'épidermolyse bulleuse. On greffe les feuillets épidermiques enrichis en cellules souches sur les zones les plus touchées. Ce type de greffes ne génèrent pas de réponse immunitaire. La même expérience était réalisée pour l'EB avec le collagène VII muté (expérience de base : laminine 5 mutée).

→ D'autres maladies qui pourraient être soignées : – Ichtyosis – Netherton syndrome – Vitiligo – Xeroderma Pigmentosum → Industrie : Utilisation des cellules pour des test in vitro : irritation, corrosion, phototoxicité, UV, cosmétique....