Centrifugación - Apuntes 1 PDF

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Documento con información sobre la centrifugación...

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CENTRIFUGACIÓN Una partícula (sólido, precipitado, macromolécula, organelo) es sometida a la fuerza centrífuga cuando es rotada a alta velocidad. ! La fuerza centrífuga (mayor a la gravedad) mueve a la partícula sobre su eje de rotación, esta fuerza depende del volumen de la partícula, las diferencias en la densidad del medio la fricción de ésta en el medio y la velocidad angular.! El principio es que dos partículas en suspensión, que tienen diferentes masas o densidades ( relación peso-volumen) se depositarán en el fondo de un tubo a diferentes velocidades.! Características

de

la

partícula:

Una partícula con mayor masa tiende a moverse más rápido que una de menor masa.! Una partícula más densa se mueve más de prisa que otra menos densa.! Cuanto más densa sea una solución, más lentamente se moverá la partícula.! A mayor coeficiente de fricción, más lento será el movimiento de la partícula.! Coeficiente de sedimentación (s). Las partículas sedimentan de acuerdo a su tamaño, forma y densidad.! 1s= 10-13 s Es la razón entre la velocidad a la que sedimenta (se va al fondo) una partícula y la aceleración centrífuga aplicada. Además, se relaciona con el radio, la densidad de la molécula y el medio (también su viscosidad)! Es que tanto sedimenta, no que tan rápido lo hace, por lo que a mayor (s) mayor peso molecular.! Equilibrio de sedimentación. La posición de las partículas ya no cambia con el tiempo, esto nos proporciona datos sobre el peso molecular, la densidad y la composición de las partículas. Esto se realiza midiendo la distribución de las concentraciones.! Tipos

de

centrifugación:!

Tipo

Aplicaciones

PREPARATIVA (Centrifugadora de baja y alta velocidad) Centrifugación diferencial (de sedimentación) Centrifugación fraccionar (por gradientes de densidades) ! 2 tipos

Separación y aislamiento de partículas en una solución. Se utiliza para precipitar organelos celulares, células y biomoléculas. Aislamiento de las partículas con base en su tamaño por centrifugaciones sucesivas con incrementos en la velocidad del rotor. Se utiliza para separar diversos organelos

1. Zonal (velocidad de sedimentación)! Separar en función de su masa! Mejor para proteínas, ya que estas varían más en masa, pero no en densidad.

El gradiente (sacarosa o glicerol) se realiza en el tubo antes de la centrifugación y la muestra se coloca en la superficie. Esta gradiente es realizada con base en que a más concentración mayor densidad, por lo que se forman capas de sacarosa. La densidad genera fricción, por lo que solo las moléculas grandes tendrán la capacidad de bajar.! Se utiliza para purificar macromoléculas y determinar el valor de s.

2. Isopícnica (equilibrio de sedimentación)! Separar en función de su densidad no por su masa

El gradiente se forma durante la centrifugación (CsCl y Cs2SO4). La densidad del CsCl se va a igual con la muestra y distribuirlas por densidad. Se utiliza para purificar macromoléculas y componentes subcelulares y determinar el valor de s.

ANALÍTICA (Ultracentrifugadora) Centrifugación diferencial

Fuerza centrífuga

!

Diferencial

Sedimentación de partículas en un medio de densidad homogénea. Se usa para medir el coeficiente de sedimentación y el peso molecular de una partícula. Zonal (velocidad de

Isopícnica (equilibrio

sedimentación)

de sedimentación)

Más lento

Menos denso

Más rápido

Más denso

Más lento

Más rápido

Mayor tamaño, mayor (s) y sedimentación más rápida (Zonal)! Usos: Se utiliza principalmente como técnica preparativa para separar un tipo de material de otros y cómo técnica analítica para medir propiedades físicas de macromoléculas (peso molecular, densidad, forma y constantes de unión en equilibrio).! Centrifugación y purificación de proteínas. Se utiliza en los primeros pasos de la clarificación del extracto celular, donde se da la separación de las proteínas solubles del

material celular insoluble por medio de centrifugación diferencial. Se busca una fuerza de centrifugación y duración adecuada para formar un sedimento. Pasos: Se vierte la mezcla inicial del extracto en el tubo y se centrifuga.! Los organelos celulares se acumulan en el sedimento, pero las proteínas solubles permanecen en el sobrenadante.! La fracción de sobrenadante todavía contiene una gran mezcla de proteínas, por lo cual se decanta y luego se somete a métodos de purificación adicionales para obtener las proteínas.!

“ Las proteínas varían mucho en masa, pero no en densidad. La densidad media de una

proteína es 1.37 g/cm3 . A menos que una proteína tenga un lípido o carbohidrato adherido, su densidad no variará en más del 15 % de este valor. ”!

Tipos

de

centrifugadora:!

Característica

Centrífuga de baja velocidad

Centrífuga de alta velocidad

Ultracentrífuga s

Velocidades min y max

1 - 6,000 rpm

1,000 - 25,000 rpm

20,000- 120,000 rpm

Tipos de rotor

De cubo oscilante y de ángulo fijo

De cubo oscilante, ángulo fijo y verticales

De cubo oscilante, ángulo fijo y verticales

Volumen de los tubos

15-20mL

50mL

20-30mL

Control de temperatura

No / Algunas

Contiene sistema de Contiene sistema de refrigeración refrigeración

Usos principales

Separación de partículas grandes, como células.

Separación de fracciones celulares, como organelos o biomoléculas.

Separación de moléculas pequeñas como ribosomas, proteínas y virus.

¿Se usa para métodos preparativos?

Sí

Sí

Sí

¿Se usa para métodos analíticos?

No

No

Sí

El grado de rotura celular durante la homogeneización se puede estimar determinando la fracción de la actividad marcadora de un orgánulo particular que sedimenta en el primer paso de centrifugación a baja velocidad (y es probable que todavía esté asociado con células), mientras que la extensión de la rotura del orgánulo se puede estimar determinando la fracción de la cantidad total de una proteína intraorganelar soluble que no es sedimentada por un giro de alta velocidad que sedimenta todo el orgánulo.! La concentración de la proteína se puede determinar al calcular la relación de actividad específica de la proteína en cada paso, esto nos proporcionara una estimación del número de veces de purificación o enriquecimiento.!

1. De los siguientes factores ¿Cuáles 5enen un efecto en la velocidad de sedimentación de una par;cula? Subraya la respuesta correcta. a) La masa de la par;cula. b) La velocidad angular de rotación. c) La presión atmosférica. d) La densidad del solvente. 4. El citocromo c 5ene un coeficiente de sedimentación (s) de 1 x 10-13 s y la hemoglobina un valor s de 4.5 x 10-13 s. ¿Qué proteína 5ene mayor peso molecular? Hemoglobina 5. Inves5ga y subraya la respuesta correcta ¿Qué significa “500 x g” de acuerdo con la centrifugación? a) La fuerza gravitacional. b) La fuerza centrífuga es 500 veces mayor que la fuerza gravitacional de la 5erra. c) La fuerza centrífuga es 500 veces menor que la fuerza gravitacional de la 5erra. d) La fuerza centrífuga es 500 veces igual que la fuerza gravitacional de la 5erra....