Chapitre 2: Assimilation de l\'azote PDF

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Sous partie du chapitre photosynthèse , ce cours à été départagé il était trop long autrement...

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Métabolisme carboné et azoté Partie V L’azote est un élément très abondant dans l’atmosphère sous forme de diazote (N 2). Il est un composant majeur des acides nucléiques, des protéines, des chlorophylles et des métabolites secondaires. L’azote organique se forme à partir de molécule de diazote. Le premier problème pour former de l’azote organique est la triple liaison entre les 2 molécules d’azote du diazote. Cette triple liaison est très stable, il faut donc beaucoup d’énergie pour la briser. De plus l’azote a plusieurs niveau d’oxydation (nombre positif) et de réduction (nombre négatif).

Assimilation de N2

L’azote entre dans le cycle par fixation de N 2 et se fait via des microorganismes libres ou en symbiose avec les végétaux. Ces microorganismes capable de réduire le N 2 en NH3 sont dits diazotropes. L’azote fixé peut aussi entrer dans le cycle via l’Homme par le nitrate NO 3- grâce à l’engrais ou par une fixation non biologique. La principale source d’azote dans le sol est sous la forme NO 3-. C’est sous cette forme que l’azote est absorbé par les racines. Le nitrate sera par la suite assimilé par réduction en nitrite et ammonium par les enzymes nitrite réductase (niR) et nitrate réductase (NR). Ces ions ammonium sont incorporé dans les acides aminés par la voie GS GOGAT ou par la voie GDH (glutamate déshydrogénase), chez les végétaux et les microorganismes. Les acides aminés formés vont servir à la formation de protéines. Il est à noter que les formes d’azote minérales oxydé comme le

nitrate ou le nitrite ou réduite comme l’ammonium sont très fortement toxique pour les animaux. On ne peut donc pas utiliser ces formes directement. Seule les végétaux et les microorganismes sont autotrophes pour l’azote et peuvent assimiler cet azote minérale. L’humus est formé par les organismes morts comme les végétaux, animaux et microorganismes et cet humus sera décomposé. Ainsi l’azote est réduit en NH3 par des microorganismes. C’est ce qu’on appelle l’ammonisation. Cette étape est suivi par la nitrification qui transforme l’ammoniaque en nitrite et nitrate. Cette nitrification se fait aussi par des microorganismes du sol. Ainsi le cycle se fait. L’azote organique est recyclé en nitrate.

La fixation de N2 lors d’orage permet la formation HNO3-. Ce HNO3- arrive sur terre via les précipitations. Cette fixation de l’azote représente 10% des fixation. La fixation biologique représente donc 90% de la fixation de l’azote. On voit que l’azote fixé peut être absorbé par les plantes essentiellement sous la forme de nitrate. Les résidus organiques seront décomposé en ammonium et oxydé en nitrite ou nitrate par les microorganismes diazotropes. Les nitrates sont souvent lessivé des sols et disparaissent.

Les acides aminé chez les mammifères sont divisés en acides aminé essentiels et non essentiels. Les plantes synthétisent les 20 acides aminés par contre les animaux doivent consommer 8 acides aminés essentiels. L’arginine et l’histidine sont des acides aminés essentiels exclusivement chez les mammifères. L’azote est l’élément le plus abondant dans l’atmosphère (80%) et c’est le 4ème plus abondant dans la matière organique, après le carbone, l’hydrogène et l’oxygène. L’azote représente souvent le nutriment pour la croissance des plantes. On voit que la productivité des plantes (rendement par hectare), est proportionnel à la concentration d’azote disponible dans le sol. Au-delà d’une certaine concentration d’azote le rendement n’augmente plus et atteint donc un plateau. L’apport des engrais en trop grande quantité ne sert à rien si on atteint le plateau et au contraire amène au lessivage des nitrates par l’eau de pluie en direction de la nappe phréatique.

On retrouve le schéma générale de l’assimilation de l’azote minéral chez les végétaux. Cette assimilation passe par la réduction du nitrate NO 3- en ion d’ammonium NH4+ qui va être incorporé dans les molécules organiques sous forme d’acides aminés. On dit que les végétaux sont des organismes autotrophes pour l’azote dû à leur capacité d’utiliser le nitrate minérale. Les microorganismes ont aussi cette capacité mais pas les animaux. Chez les végétaux ce métabolisme est compartimenté et se déroule dans le cytoplasme et dans le chloroplaste. D’abord le nitrate entre via des transporteurs dans le cytoplasme, les nitrates sont réduit en nitrite par la nitrate réductase. Les nitrites très toxiques seront transporté dans le chloroplaste où ils sont réduit en ammonium par la nitrite réductase. Ces 2 étapes de réduction sont très endergonique et compte 10 ATP par N réduit. L’incorporation de l’azote dans les molécules organiques se fait également dans le chloroplaste avec la synthèse d’un premier acide aminé, le glutamate grâce à 2 enzymes : GS et GOGAT. Cette synthèse nécessite 2 ATP supplémentaires. Le glutamate peut céder ensuite un groupement aminé grâce à des aminotransférases pour la synthèse d’autres acides aminés qui seront à la base de l’ensemble du métabolisme de l’azote et donc de la synthèse des protéines et des acides nucléiques.

Ci-contre on a une autre représentation de l’assimilation de l’azote. On voit que les transporteurs de nitrate sont très nombreux chez les plantes. Ils fonctionnent tous par cotransport : un proton transporté avec un NO3-. Ce transport se fait grâce à la force protomotrice créer par les ATPase qui sont des pompe à proton de la membrane plasmique des cellules végétales. On peut voir la réduction du nitrate et que les nitrates peuvent être stocké dans la vacuole de la cellule.

L’ensemble des enzymes présent dans l’assimilation de l’azote sont des oxydoréductases qui catalysent des transferts d’électrons d’un donneur réduit à un accepteur oxydé. Ces enzymes possèdent donc des cofacteurs capable d’assuré ces transferts. Pour pouvoir réduire le cofacteur il faut donc un pouvoir réducteur. On a vu que les processus photosynthétiques converti l’énergie lumineuse en énergie chimique et en pouvoir réducteur utilisé pour l’absorption du carbone minéral. Ce pouvoir réducteur est aussi utilisé pour d’autre métabolisme dont l’assimilation de l’azote minéral plus particulièrement dans la réduction de ions nitrate en nitrite.

La nitrate réductase est une enzyme complexe constitué d’un dimère de protéine et de 3 co-enzymes (FAD, MoCo et Hème Fer). La protéine est composé de sous-unités identiques. Chaque sous-unité est formé par une chaîne polypeptidique contenant 3 cofacteurs : FAD, un hème sirohème et cofacteur métallique MoCo. La nitrate réductase catalyse la réaction suivante : NO3- + 2 e- + 2H+  NO2- + H2O Le donneur d’électrons et de proton est le NADPH,H+, ce donneur est fournie par le métabolisme respiratoire. Il provient soit d’un surplus de la photosynthèse (phase photochimique) soit du cycle oxydatif du pentose phosphate. Les électrons sont transférés à partir du NADPH au FAD puis à l’hème et enfin au MoCo, qui cède finalement ses électrons aux ions nitrate pour former finalement du nitrite. La seconde enzyme impliqué dans l’assimilation du nitrate est la nitrite réductase chloroplastique, l’absorption de la nitrite se faisant dans le chloroplaste. C’est une enzyme monomérique associé à 2 cofacteurs :  Un complexe fer-soufre  Un hème sirohème La nitrite réductase catalyse la réaction suivante : NO2- + 6 e- + 8H+  NH4+ + 2H2O Le donneur d’électron est la ferrédoxine réduite issu du fonctionnement de la phase photochimique de la photosynthèse. Les nitrites étant particulièrement toxique donc l’activité nitrite réductase est très importante par rapport à l’activité nitrate réductase et est considéré comme l’étape limitante de l’assimilation de l’azote. L’activité nitrate réductase est strictement régulé de façon à ne pas permettre la formation des nitrites que dans des condition où ils seront efficacement réduit en ammonium.

La régulation de la nitrate réductase empêche l’accumulation de nitrite qui est très toxique pour la plante. Il existe des régulation au niveau de l’expression du gène codant la nitrate réductase qui permet des régulations lentes de l’ordre de quelques heures. Un des principaux facteurs inducteur de la transcription du gène NR est le nitrate lui-même, qui permet de coordonner l’expression du gène avec la présence direct du substrat de l’enzyme. Sur le graphe on voit l’expression du gène nitrate réductase en fonction de la concentration du substrat nitrate. L’expression du gène est quantifier en mesurant la présence relative du ARNm du gène. On constate une induction de l’expression du gène nitrate réductase après quelques heures d’exposition nitrate aussi bien dans les feuilles que dans les racines. Cette expression se stabilise ensuite. La lumière est aussi un inducteur de la transcription du gène NR.

L’activité nitrate est aussi sujette à des régulations rapides de l’activité nitrate réductase en quelques minutes qui permettent un ajustement extrêmement fin de l’activité. Ces régulations ont lieu au niveau post-traductionnel et modifie l’activité enzymatique de la protéine par exemple par la phosphorylation de l’enzyme. Sur ce diapo l’enzyme nitrate réductase est schématisé en montrant les 3 cofacteurs, le FAD, le hème et le MoCo. Tout a gauche, on voit l’enzyme dans sa forme active qui peut être phosphorylé par la nitrate réductase kinase et cette phosphorylation est réversible par l’action d’une phosphatase ici la PP2A. La phosphorylation de la nitrate réductase permet la fixation d’une protéine régulatrice 14-3-3 ce qui rend la nitrate réductase inactive et peut amener à sa dégradation. La fixation de cette protéine est réversible. Le principal facteur de régulation de ce type est la lumière qui inhibe la phosphorylation et garde l’enzyme active, mais également d’autre facteurs tels que le stress , la disponibilité en CO2 et donc en sucre agissent de cette manière.

On retrouve ici un schéma simplifié des facteurs principaux de la régulation de la voie d’assimilation des nitrates. La nitrite réductase fonctionne dans les feuille qu’à la lumière car il y a nécessité de ferrédoxine former que lors de la phase photochimique de la photosynthèse.

Sur cette diapositive on voit la synthèse des acides aminé. L’azote sous la forme NH 4+ est incorporé dans les molécules organiques sous forme d’acides aminés. Le NH 4+ est formé soit pas réduction des nitrates soit par absorption directe dans le sol ou fournit par remobilisation des acides aminés recyclés ou par la photorespiration. La voie majoritaire chez les plantes pour la synthèse des acides aminés est une cycle métabolique faisant intervenir 2 enzymes : GOGAT(glutamine-2- oxoglutarate aminotransférase) et GS (glutamine synthétase) qui se fait au niveau des feuille dans les chloroplastes. La GS fixe un groupement amine sur le glutamate pour donner la glutamine. La GOGAT transfert un groupement aminé (entouré en rouge) de la glutamine à l’oxoglutarate pour former un glutamate réutilisé dans le cycle. La glutamine désaminé va devenir un deuxième glutamate par la désamination qui sert à l’incorporation dans d’autre acides aminés par de multiple aminotransférase. Ce système permet la synthèse net d’un glutamate et le recyclage d’un glutamate pour la fixation d’un nouvel ion d’ammonium. Le métabolisme azoté est associé au métabolisme carboné vu le besoin du 2oxoglutarate.

Les sucres fournissant les squelettes carbonés qui composent les acides aminés aussi régule la nitrate réductase. Ces sucres issu du cycle de Krebs agissent comme inducteurs transcriptionnel de la nitrate réductase.

Nous allons voir la fixation biologique de l’azote moléculaire. On va voit l’entrée de N 2 via une fixation biologique. Cette fixation est réalisé par des microorganismes libre ou en symbiose avec les végétaux. La réduction de l’azote via des processus biologique est possible grâce à l’enzyme nitrogénase. Seulement les microorganismes possèdent cette enzyme. On peut citer 2 microorganismes capables de fixer l’azote :  Anabeana : cyanobactérie autotrophe et fixatrice d’azote. La nitrogénase est dans les hétérocystes  Azotobacter : bactérie hétérotrophe fixatrice d’azote (cyste avec nitrogénase)

La nitrogénase catalyse 3 réductions successives (ci-dessus). Cette réaction très consommatrice d’énergie.

La nitrogénase est un complexe composé de 2 enzymes différentes :  Dinitrogenase réductase : composé de 2 sous-unités qui contient un complexe fer-soufre. Grâce à l’hydrolyse de l’ATP on réduit la dinitrogenase en transférant les électrons d’un donneur, la ferrédoxine au cofacteur de la dinitrogenase  Dinitrogenase : Elle est hétérotramérique c’est-à-dire composé de 2 sous-unités α et de 2 β. Elle contient un facteur métallique qui permet la réduction de N2 en NH3. La fixation biologique de l’azote via la nitrogénase des diazotropes se fait aussi dans les racines au niveau des nodosités. Ces nodosités contiennent des bactéries diazotrophes symbiotiques, par exemple le genre rhizobium. Les nodosités formé par la plante sont des excroissances racinaires qui accueillent les rhizobium. Les cellules des nodosités sont remplis de bactéries qui se transforment en bactéroïdes une fois à l’intérieure des cellules végétales. Les bactéroïdes ne sont pas en contact direct avec le cytoplasme mais sont entourés d’une membrane. Cette membrane se forme lors de l’entrée des bactéries dans la cellule végétale. On appelle cette structure le symbiosum et c’est dans ce symbiosum que la nitrogénase des bactéries est active.

Pour entrer dans les racines, les rhizobium infectent les poils racinaires. Les poils racinaires se recourbent pour former une niche particulière. Les rhizobium vont s’accumuler dans cette courbure et entrer par la suite à l’intérieure du poils absorbant. Les bactéries avancent à l’intérieure du poil absorbant via un cordon d’infection formé par la cellule végétale à l’intérieure du poil.

Sur ce schéma on voit les modalités de mise en place des nodosités. Les plantes qui peuvent former les rhizobium sont des légumineuses (haricot vert, soja…). Les racines émettent des signaux chimiques attracteurs qui attirent les rhizobium. Ces molécules sont des flavonoïdes. Les rhizobium s’approchent donc des poils absorbants et induisent la courbure du poil (1). Les bactéries entrent dans les poils via les cordons d’infection et avancent jusqu’au parenchyme cortical de la racine (2). Ces cellules deviennent méristématiques, se divisent fortement et forme la future nodosité (3). La nodosité s’agrandit et les bactéries continuent de l’infecté (4). On distingue différentes zones dans la nodosité (4). Les bactéries installées dans la zone centrale se transforment en bactéroïdes et fixe l’azote moléculaire. La nitrogénase est inhibé par l’oxygène moléculaire d’une façon irréversible. Dans les cyanobactéries la nitrogénase et la fixation du N 2 se trouvent dans des cellules spécialisées, les hétérocystes qui ne laissent pas passer l’O2. La nitrogénase des bactéroïdes, qui se trouve dans les cellules des nodosités est aussi protégé contre des concentration de dioxygène élevé. Ceci se fait par la présence de la leghémoglobine qui fixe l’oxygène moléculaire. Cette protéine est synthétisée par les plantes.

Sur ce schéma on voit le fonctionnement d’une cellule à bactéroïdes dans une nodosité. Dans cette cellule se trouve le symbiosum. L’oxygène qui entre dans la cellule végétale va être capté par la leghémoglobine et ne peut donc pas diffuser à l’intérieure du symbiosum où se trouve la nitrogénase. Par contre la fixation du N2 par la nitrogénase à l’intérieure de la bactéroïde nécessite beaucoup d’énergie donc beaucoup de respiration. Pour limiter l’oxygène libre dans la cellule la leghémoglobine va également fournir cet oxygène à la chaîne respiratoire de la bactérie. L’énergie libéré par la respiration sous forme d’ATP est ensuite utilisé pour le fonctionnement de la nitrogénase. La cellule végétale fournit les sucres en forme de malate à la bactérie qui grâce au cycle de Krebs, produit le pouvoir réducteur en forme de NADH puis en ferrédoxine nécessaire pour la réduction du N 2. L’ammoniac ainsi fournit, exporté et utilisé dans la voie GS-GOGAT pour la production du glutamate.

On a un schéma simplifier du fonctionnement de la symbiose rhizobium-légumineuse. Schéma général de l’assimilation de l’azote minéral chez un végétal avec (à droite) ou sans (à gauche) association symbiotique fixatrice d’azote moléculaire. Dans le cas de la symbiose l’azote moléculaire, le N 2 atmosphérique peut être utilisé contrairement au scénario sans rhizobium où les plantes absorbent le nitrate ou le NH4+ minérale. Dans le cas sans symbiose en condition de faible disponibilité de nitrate, ces derniers sont rapidement réduit dans les cellules racinaires en NH4+ et réutilisé pour la formation des acides aminés. Les acides aminés surtout le glutamate peuvent être exporté vers le reste de la plante. Dans le cas non symbiotique, le nitrate peut être stocker dans les vacuole en condition de grande disponibilité où être exporté par la sève brute vers les feuilles où ils vont être stocké ou réduit dans les chloroplastes.

Pour conclure ce chapitre on peut voir le lien entre le métabolisme carboné et le métabolisme azoté. Le cycle de Calvin assimile le CO2 dans le chloroplaste et la sortie d’un carbone organique en forme de triose phosphate. Ce carbone organique en C3, peut être stocké sous forme d’amidon dans le chloroplaste ou exporté vers le cytoplasme sous forme de saccharose. Ces sucres fournissent le glucose qui est transformé en pyruvate via la glycolyse dans le cytoplasme qui va entrer dans la mitochondrie. L’α-cétoglutarate par l’intermédiaire du cycle de Krebs va fournir le squelette carboné sur lequel l’ion NH4+ sera incorporé pour la synthèse du glutamate dans le chloroplaste. La transamination, le glutamate est à l’origine d’autres acides aminés. D’autres acides aminés sont formé ailleurs dans le cycle via la transamination....