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Chapitre 6 Enzymes – Mécanisme d’action Exemple de la luciole Une luciole produit de la lumière grâce à un enzyme, la luciférase.  Elle catalyse une réaction qui utilise de l’O2, de l’ATP et un substrat, la luciférine qui n’est pas luminescente.  On utilise aussi cette enzyme en labo pour détecter certaines molécules d’intérêts par luminescence.

Importance biomédicale Définition Les enzymes sont des polymères biologiques qui : -

Catalysent des réactions chimiques nécessaires à la vie ;

-

Sont le plus souvent des protéines et parfois des ARN catalytique, les ribozymes ;

-

Sont utilisées pour le catabolisme des nutriments (donne de l’énergie) et la synthèse de molécules complexes à partir de constituants chimiques de base (ADN, protéine, membrane, etc).

Domaine de la recherche et de la médecine 1) On fait la mesure de l’activité d’enzymes spécifiques dans les fluides ou extraits cellulaires pour diagnostiquer et faire le pronostic de maladies.  Les défauts de concentration ou d’activité d’enzymes peuvent être causés par un défaut génétique, des carences alimentaires ou des toxines (bactéries). 2) On les utilise pour des stratégies thérapeutiques comme agents inhibiteurs d’enzymes trop actives et pour la thérapie génique (rétablit un gène codant pour une protéine) qui augmente la concentration d’une enzyme. 3) On utilise les enzymes dans l’industrie en solution ou après immobilisation sur un support, pour catalyser la synthèse de médicaments, pour des intolérances au lactose en l’hydrolysant à la lactase pour permettre la digestion, et dans les lessives, détergents et fromages (chymosine, rénnine) on utilise des enzymes protéolytiques.

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Les enzymes = catalyseur En laboratoire, dans des conditions physiologiques, si on laisse une protéine en milieu aqueux on constate qu’il y a une hydrolyse de la liaison peptidique après environ 20 ans (1/2 vie).  Présente un avantage pour certaines protéines car on préfère garder une stabilité, comme pour les protéines de structures.  Présente un désavantage pour d’autres protéines donc l’action n’est pas utile constamment comme c’est le cas pour les hormones qui doivent agir vite mais pas en continu.

Comment augmenter la vitesse d’une réaction chimique ? Pour qu’une réaction se produise, les réactifs doivent se rencontrer  Théorie cinétique/de collisions. Pour réagir, 2 molécules doivent : 1) Entrer en collision car la distance qui les sépare permet la formation de liaisons ; 2) Posséder une énergie cinétique suffisante pour passer la barrière d’activation afin de rompre les anciennes liaisons et d’en former de nouvelles.  Atteindre l’état de transition = état où les substrats entrent en catalyse (plus tout à fait substrat mais pas encore totalement produit).

1. La température influence la vitesse de réaction Plus la température augmente, plus l’énergie cinétique des molécules augmentent  les molécules passent la barrière d’énergie. En A, il n’y a que le substrat qui n’a pas encore assez d’énergie pour passer la barrière. En B, l’augmentation de T° provoque le mouvement des molécules qui entrent en contact. L’énergie augmente et le substrat commence à se transformer. En C, le produit est enfin formé.

2. Les concentrations des réactifs influencent la vitesse de réaction Plus la concentration en réactifs augmentent, plus leur chance de se rencontrer est de faire la réaction augmente.  Par contre dans une cellule, il y a tellement de molécules différentes dans un espèce tellement petit que les concentrations sont souvent trop faibles. De plus, augmenter la T° n’est pas possible on ne peut dépasser les 37° sinon les protéines se dénaturent.

3. L’ajout d’un catalyseur influence la vitesse de réaction Le catalyseur participe à une réaction biochimique et retrouve toujours sa forme initiale à la fin de cette réaction  rôle joué par les enzymes dans nos cellules, elles augmentent la vitesse de nos réactions en diminuant son énergie d’activation sans être affectée.

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Caractéristiques sur les enzymes Les enzymes sont des protéines Exemple de la chymotrypsine qui clive les liens peptidiques : -

Le repliement de sa chaine polypeptidique se fait en 2 domaines ce qui offre une fente où a lieu la catalyse = site actif de la chymotrypsine, composé de 3 aa essentiels pour la catalyse.

-

La catalyse accélère la vitesse de la réaction d’au moins 106 fois  hydrolyse du lien peptidique au rythme de 190 réactions par seconde au lieu de 20 ans pour la moitié des substrats.

Exemple de l’anhydrase carbonique : -

Rôle dans le transport du CO2 (chap5).

-

Catalyse 1 millions de réaction par seconde au lieu de 5 secondes pour la moitié des substrats.

Les enzymes ont un site actif où a lieu la catalyse Le substrat se lie au site actif grâce à des liaisons non covalentes avec les chaines latérales des aa. Un cofacteur (ion) vient stabiliser le substrat en faisant un « pont » entre l’aa et le substrat grâce aux liaisons NC. Le substrat a une conformation particulière propre au site actif, il ne rentrera que dans le site actif lui correspondant.

L.’enzyme agit comme un catalyseur en se liant au substrat et en facilitant la réaction en stabilisant son état de transition vers un produit spécifique.

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Les enzymes sont des catalyseurs efficaces et hautement spécifiques -

Elles sont spécifiques de leurs substrats et leurs produits (par rapport à la stéréoisomérie et au type de réaction).

-

Elles ont une grande efficacité de catalyse.

-

Elles reviennent toujours à leur état initial après la réaction, si pas elles ne sont plus fonctionnelles.

-

Les groupements fonctionnels dans le site actif sont disposés de manière précise, c’est pour ça qu’il n’y a qu’un substrat qui lui est propre qui peut se lier à l’enzyme  il y a 3 points d’attachement du substrat au site catalytique, le produit de l’enzyme est chiral.

Les enzymes peuvent être régulées L’organisme peut répondre à des besoins, à des changements de conditions ou exécuter des programmes de développement génétiquement déterminés.  Existence de mécanismes de régulation pour réguler l’action des enzymes. Exemple de la régulation hormonale : -

Si je viens de manger beaucoup de sucre, ma glycémie augmente  synthèse et libération d’insuline qui va venir agir sur les muscles et les tissus adipeux pour mettre des transporteurs de glucose au niveau des membranes afin de récupérer le glucose et de la cataboliser  glycolyse doit être activée et rapide.

-

Si je n’ai pas assez mangé, le taux de sucre diminue et la glycolyse ne doit pas être active donc on va activer les voies métaboliques qui vont permettre de faire du glucose  dégradation du glycogène du foie et des muscles pour faire une néoglucogenèse à partir des précurseurs  diminution de la glycolyse au profit de la néoglucogenèse.

 Régulation des enzymes en ajoutant des groupements pour les rendre active ou les inhiber. Phosphorylation du glucose quand il rentre dans la cellule pour l’empêcher de sortir. Glut 2 = protéine constitutive, constamment exprimée.

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Les enzymes sont classées selon le type de réactions catalysée

Les enzymes dites isoenzymes ou isozymes = enzymes de conformation différente mais catalysant une même réaction. -

Ont une origine commune = enzyme homologue.

-

Propriétés catalytiques qui leur sont propres.

-

Exprimées dans différents tissus ou à différents moments du développement.

-

Peuvent avoir des fonctions métaboliques légèrement différentes.

-

Elles ne reconnaissent pas le même aa, elles hydrolysent après un aa différent chacune (cible particulière).

Rôle des groupements prosthétiques, des cofacteurs et des coenzymes -

Groupes chimiques supplémentaires dans le site catalytique.

-

Augmentent la variété des groupes réactionnels dans les sites catalytiques des enzymes.

1. Cofacteurs

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-

Association transitoire avec l’enzyme ou le substrat.

-

Est un ion métallique (= métalloenzymes) ou de l’ATP.

1. Les coenzymes o Elles sont dérivées des vitamines hydrosolubles (vitamine B) qui sont les précurseurs des sites catalytiques.

o

Elles sont impliquées dans des réactions de transfert de groupe = navettes recyclables, rentrent et sortent des sites catalytiques.

o

Si elles sont fermement liées à l’enzyme pour toujours, ce sont des groupements prosthétiques (pas une protéine mais essentielle à la protéine)  FAD et FMN.

Le NAD+ peut accepter un proton sous la forme d’hydrure H- et transférer un H+ en même temps = navette. La forme réduite donne un électron = délocalisation.

La lactate déshydrogénase arrache un H- et un H+.

Vitamines = précurseurs Niacine (B3) Riboflavine (B2)

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Coenzyme Nicotinamide adénine dinucléotide (phosphate) (NADP) Flavine mononucléotide et flavine adénine dinucléotide (FMN et FAD)

Réactions Oxydo-réductions Oxydo-réductions

La chimie de la catalyse L’énergie libre de Gibbs (G) des substrats et des produits On veut transférer le groupe B vers le groupe C, pour que la réaction ait lieu il faut que les substrats soient à proximité sans être trop proches pour éviter les répulsions sauf si l’énergie libre est suffisante.

 On doit alors considérer le G de chaque substrat et de chaque réactif à l’état initial et à l’état final pour calculer la différence entre les 2 et déterminer la variation d’énergie libre qui va nous indiquer le sens de la réaction chimique (attention, pas la vitesse) :

 La réaction se spontanée/thermodynamiquement favorable si Gsubstrats > Gproduits et donc si

∆ G au maximum du graphe, c’est l’état de transition (complexe activé). Sur le 2ème graphe, l’énergie libre est plus basse que sur le 1er.

 On peut aussi le calculer d’une autre façon :

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L’énergie libre d’activation

∆G

*

Energie libre d’activation = passage des réactifs vers le complexe activé.  Représente la barrière énergétique = énergie à fournir que pour que la réaction se produise (différence entre Ginitial et Gfinal).

Le maximum représente l’état de transition, considéré comme un intermédiaire entre les réactifs et les produits.  Le T1/2 vie de ces états est très court, on ne peut donc pas les analyser en labo.  Il correspond à une espèce moléculaire en transition entre le substrat libre et le produit.  Les pointillés représentent la liaison en train de se rompre et la liaison en train de se former. La réaction peut se

décomposer en 2

réactions partielles :

La hauteur de la barre d’énergie d’activation détermine la vitesse de la réaction (qtt de produit formé par unité de temps) : -

Si elle est élevée, il y a moins de chance que la réaction se fasse par unité de temps = réaction lente.

-

Si elle est basse, il y a plus de chance que la réaction se fasse par unité de temps = réaction rapide.

 Les molécules qui peuvent atteindre cet état de transition et être transformées sont celles qui sont suffisamment excitées quand elles s’entrechoquent : o

En labo, on chauffe le tube à essai pour provoquer une augmentation de l’agitation thermique des molécules ce qui accélère la réaction.

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o

Dans une cellule, la T° est « douce » (37°), les enzymes vont alors diminuer la hauteur de la barrière d’activation pour accélérer la vitesse de la réaction car cette diminution rend propice la rencontre des substrats.

Un catalyseur fournit un chemin réactionnel avec une barrière d’activation plus basse A l’état de transition, il y a 2 options possibles : -

Soit on recommence la

réaction ; -

Soit on forme les produits.

Différences entre énergie libre et énergie d’activation -

L’énergie libre donne le sens de la réaction, si elle est spontanée ou non = G le substrat droit franchir ces 2 barrières.

Exemple de la transamination : -

Réaction catalysée par la transaminase pour la biosynthèse de l’urée et certains aa.

-

Consiste en un échange entre une fonction amine et

une

fonction cétone. -

Dans le cycle du citrate, les métabolites sont en concentration égales, la transaminase fait donc en

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sorte

de maintenir cette concentration en convertissant soit l’aa soit le métabolite pour maintenir l’homéostasie.

La catalyse covalente obéit à un mécanisme de ping-pong : Dans le cas de la transamination : 1) Situation de départ : l’enzyme est liée à un 1er substrat. 2) L’alanine, si elle est à bonne distance, va venir faire une liaison covalente transitoire avec l’enzyme. 3) Cette liaison provoque un échange de la fonction cétone en amine, l’alanine est alors convertie en pyruvate. 4) Le pyruvate rompt sa liaison covalente avec l’enzyme et sort du site catalytique, l’enzyme ne possède maintenant qu’une fonction amine elle doit donc revenir à son état de départ.  On a formé un 1er produit : le pyruvate. 5) Un acide

α

cétonique, ici l’alpha-cétoglutarate, va venir faire une liaison transitoire

avec l’enzyme et ce 2ème substrat. 6) Le cétoglutarate va être transformé en glutamate et il y a un échange entre la fonction amine et une fonction cétone. 7) Le glutamate rompt sa liaison covalente et s’en va du site actif, l’enzyme est enfin revenue à conformation initiale.  2ème produit : le glutamate.

La catalyse par ion métallique 11

 1/3 des enzymes ont besoin de la présence d’un ion métallique. Il y a 2 types : -

Les métalloenzymes où les ions métalliques sont fortement liés (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Mn2+, Co3+). -

Les enzymes activées par les métaux où les ions plus faiblement liés (Na+, K+, Mg2+, Ca2+).

Les ions métalliques ont plusieurs rôles : -

Ils jouent un rôle d’accepteur d’électrons dans les catalyses d’oxydo-réduction = changement réversible de l’état d’oxydation de l’ion métallique.

-

Ils stabilisent par effets électrostatiques ou en masquant les charges négatives d’un enzyme (si enzyme a besoin d’ATP, elle rentre dans le site catalytique en étant négative, le

Mg2+ par exemple va venir masquer cette charge). -

Ils se lient aux substrats pour les orienter correctement pour la réaction.

Par exemple, dans une réaction catalysée par l’alcool déshydrogénase hépatique, l’ion zinc va stabiliser l’état de transition.

La catalyse par liaison préférentielle à l’état de transition  Catalyse où une liaison covalente doit être rompue. L’enzyme se fie au substrat dans une conformation défavorable pour induire la rupture de la liaison et forcer l’état de transition ce qui facilite la conversion des substrats en produits. 1) Difficile de casser la barre rien qu’avec nos forces -> recours à une enzyme. 2) La barre se fixe au site catalytique mais dans une conformation qui ne favorise pas la cassure (petits carrés représentent les chaines latérales des aa).

3) Une autre enzyme vient intervenir, plus favorable car sa conformation est meilleure pour forcer l’état de transition nécessaire à la rupture.

 Il y a intérêt pour la recherche chimique et pharmaceutique car on peut synthétiser des analogues de l’état transition et les utiliser comme inhibiteurs d’enzyme et mettre au point des médicaments. Il existe 2 modèles de liaison substrat-enzyme : 1) Emile Fischer = clé-serrure mais pose un problème de rigidité.

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2) Daniel Koshland = main-gant (E-S).  Théorie de l’ajustement induit = quand une enzyme se lie à son substrat, cela induit un changement de conformation et favorise la catalyse. Par exemple, quand l’hexokinase se fixe au glucose elle change de conformation et convertit le glucose en glucose-6-phosphate.

 L’environnement du site

actif diminue

l’énergie libre en

stabilisant

l’état de transition car

l’enzyme se lie

plus fort à l’état de

transition

qu’aux substrats et aux

produits.

La stabilisation met en jeu : 1) Des groupements

acide-base qui

aident aux

transferts de

H+ de ou vers l’état

de transition.

2) Des groupements

chargés et ions

métalliques qui

stabilisent les

charges. 3) Des contraintes stériques qui déforment le substrat et imposent un seul chemin réactionnel (catalyse covalente où l’intermédiaire est liée à l’enzyme).

Exemples de mécanismes enzymes La catalyse d’une protéase à acide aspartique : la catalyse acido-basique La

protéase de HIV permet le clivage (par hydrolyse) des liaisons peptidiques permettant l reconstitution des particules virales.  Durant la réaction, la protéase a recours à un co-substrat pour l’hydrolyse, l’eau.  Elle possède 2 résidus aspartyles, un en forme basique et l’autre en forme acide dans le site catalytique.

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1) La protéine à cliver rentre dans le site catalytique en même temps que l’eau qui se positionne sur la chaine latérale de AspX (forme basique) car sous cette forme, l’aa peut accepter un H+ qu’il arrache de la molécule d’eau et former ainsi une liaison OH. La molécule d’eau devient alors un ion hydroxyle très électronégatif, comme c’est un bon nucléophile, l’oxygène de la molécule vient attaquer le carbone de la liaison peptidique.  L’enzyme aide au transfert de H+.

2) Il y a un système de délocalisation d’électrons, l’amine de vient alors nucléophile à son tour et refait une liaison avec l’hydrogène de AspY ce qui rompt le lien peptidique.

3) On revient à la conformation de départ mais dans une seconde catalyse, ça sera AspY qui jouera le rôle de base et commencera la catalyse et ainsi de suite.

La catalyse d’une protéase à sérine C’est la catalyse de la chymotrypsine qui possède une triade catalytique Asp, His et Ser qui, lors de la catalyse, vont servir de réseau de relais de charges.  Les contraintes stériques vont imposer un seul chemin réactionnel.

Pas 102, 103 et 104 car la position dépend de la SIII et du repliement de la protéine.

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 Il y a un système de délocalisation d’électrons, l’azote de l’histidine devient nucléophile et le relais de charges continue en sens inverse du premier. En 3, la liaison peptidique est clivée mais un morceau de la protéine est encore attaché au site de façon covalente, l’eau l’aide à se détacher et revient à son état de départ.

Outils et techniques Méthode de détection de l’activité enzymatique Dans une cellule, il y a une faible quantité d’enzyme donc la détecter est difficile mais l’avantage est que, comme l’enzyme transforme leur substrat en produit, on peut mesurer leur activité qui

est proportionnelle à la quantité d’enzyme présente d’où on peut en déduire leur concentration.

Enzymologie des molécules isolées Pour ce type de détection, on tire avantage des nanotechnologies car comme on travaille sur de petits substrats avec des petites concentrations, elles aident à mesurer ces faibles concentrations.  Besoin d’un microscope à fluorescence.  Besoin d’isoler l’enzyme et le substrat pour purifier.

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