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Clase 7 (05/04/17) Análisis de Histograma El histograma es un gráfico en donde se representa la distribución de frecuencias. La campana de gauss es una distribución estadística, donde lo más representativo se encuentra en el centro, esto genera dos polos extremos, que por lo general tiene 95% de representatividad, con 2,5% hacia lo alto y 2,5% hacia lo bajo. También representa un rango de referencia, con lo cual se puede calcular, por ejemplo, el puntaje de la PSU, la natalidad, la normalidad, muchas enfermedades, asó como análisis estadísticos que se realizan en base a un histograma. En laboratorio analizaremos histogramas y los ocuparemos para ver poblaciones de los glóbulos rojos, el tamaño de estos, su coloración y el promedio de tamaño de glóbulo rojo. Principios de medición Los equipos hematológicos, ya sean muy básicos o de alta gama, utilizan distintos principios de medición. 

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Impedancia eléctrica. Todos los contadores hematológicos utilizan el principio de impedancia eléctrica. Es un método que se inventó hace muchos años, llamado también principio Coulter. Permite contar los elementos formes de la sangre, como glóbulos rojos, plaquetas y leucocitos. Citometría de flujo. Tiene la capacidad de otorgar fluorescencia (el equipo que se encuentra en laboratorio tiene la capacidad de teñir elementos y de entregar cierta fluorescencia, por lo que se consideraría como un citómetro de flujo). Fluorescencia y dispersión óptica. Es tal como el citómetro, es un láser que impacta en un elemento y choca frontal formando dispersiones (frontal, lateral).

Impedancia electrónica o la resistencia a la corriente continua (cc) de bajo voltaje fue desarrollada por Wallace Coulter en la década de 1950 y es la metodología utilizada con mayor frecuencia} La radiofrecuencia (RF) o la resistencia a la corriente electromagnética de alto voltaje a veces se utiliza junto con la impedancia electrónica de la CC. Historia Wallace y Joseph Coulter. Con ellos nace el conteo de glóbulos rojos de forma automatizada, ya que antes se contaban en cámaras al igual que los leucocitos actualmente (solo para líquidos biológicos). Como saben, los glóbulos rojos son millones por milímetro cubico, a diferencia de los leucos que son miles por milímetro cúbico, por lo tanto, en un conteo de glóbulos rojos se puede tener mucha dispersión, muchos elementos, por lo que se debe hacer muchas diluciones, y entre más se diluye la muestra, más alejado se estará de la precisión. El primer contador fue descrito por ellos en el año 56, y desde ese año se han fabricado contadores. Los métodos se basan en un sistema de medición no óptico, y la cuantificación excede a 6000 células individuales por segundo, es decir, cuenta muchas células. Una persona a lo más cuanta 500 elementos en una cámara y luego, a través de una multiplicación se llega a un recuento estimativo. El número de células cuantificadas es aproximadamente 100 veces mayor que los recuentos microscópicos, por lo tanto es mucho más preciso. Principio del conteo y tamaño ERI/LEU/PLT “Se basa en la variación de la impedancia (resistencia) por el paso de la célula por un micro orificio.” El principio se basa en esto: Hay una membrana en un canal de recuento de elementos en donde hay un polo positivo y un polo negativo, en donde se hace fluir la muestra y los distintos elementos pasan por una abertura. Esa abertura genera un pulso eléctrico, (cuando se junta un cable negativo y uno positivo se

genera un pequeño hilo de corriente) esa corriente es lo que se está generando en ese circuito. Cuando pase el elemento por ahí interrumpe la corriente, por lo tanto, ese es el principio de Coulter o de impedancia; es la interrupción de la corriente en un cierto tiempo. Esto permite dos cosas: 1. Cuantificarlo. Porque cada elemento que pase va a ir cortando la corriente y es genera un pulso eléctrico. 2. Medir el elemento. Obviamente que si es más grande el elemento más tiempo va a durar la interrupción de la corriente, es directamente proporcional. Antiguamente, los contadores que existían (Ej. LH750) tenían una pantalla, que mientras pasaba la muestra se generaban muchos pulsos rápidamente; era un análisis rápido de un minuto. Cada pulso o pick alto el equipo lo tiende como un glóbulo rojo, el pick más bajo lo interpreta como una plaqueta; al leucocito lo descarta porque es un elemento nucleado, por lo que hay que tener mucho ojo con los eritoblastos, por que el equipo es capaz de contarlo como un leucocito, un elemento nucleado.

El glóbulo rojo pequeño cuando pasa por la apertura genera un pick bajo, que en algunos casos cuando el glóbulo rojo es muy microcitico, por ejemplo en una talasemia con VCM muy pequeñas con 50 fL o menos, pueden pasar como una plaqueta o viceversa, una plaqueta que sea muy grande de unos 35-40 fL pueden pasar como glóbulo rojo, ahí es donde hay problema, hay que aclarar si esto está bien o el equipo está contando células o elementos formes que no son. Este es el detalle que hay que revisar por eso el SAR hace análisis de hemograma de forma automatizada con un tipo de contador, pasan la muestra y ven lo que dan, ahí no hay análisis rebuscado para ver si realmente hay un elemento como un glóbulo rojo o una plaqueta. (mal mal mal) Los elementos muy grandes interrumpen mucho la corriente, por lo tanto el pick es mucho más alto. Cada uno de estos elementos contados, además de contarlos, puedo medir su volumen y van cayendo en las cuadriculas en una posición, uno dividido en 89 fL, cuadricula 89, otro dividido en 90, cuadricula 90, y así se va formando esta distribución. El histograma refleja la distribución volumétrica de los eritrocitos. La campana de Gauss entrega dos datos:  El promedio de los glóbulos rojos, en donde hay una línea central y la proyecto en el eje X , aquí va a ir el volumen del elemento, y en el eje Y va a ir la cantidad de glóbulos rojos contados; esa cantidad de glóbulos rojos contados, el promedio va a ser, por ejemplo, 85 fL en un paciente normal, ese es un VCM, volumen corpuscular medio.  El ancho de la curva va a representar que tan diferente son los tamaños, si son muy chicos y normales, o son muy chicos y muy grandes, o son normales y muy grandes, o normales, hay varias conjugaciones; esa diferencia de tamaño se le conoce como Anisocitosis, y el equipo lo entrega como RDW (siglas en inglés). También se observa el grafico de las plaquetas. El equipo o los sistemas informáticos esquematizan o hacen que este grafico de abajo se vea muy similar al de arriba, pero con una unidad de famtolitros mucho menor. Cuando hay macro plaquetas hay problemas por que el equipo no entiende bien si son macromoléculas o no, y se pueden entremezclar ciertos gráficos, por eso es importante analizar estos histogramas.

La variación del volumen del eritrocito basado en el VCM va a indicar si hay glóbulos pequeños, normal, o grandes, dependiendo entonces de la medida. Pueden ser microcitico, normocitico, o macrocitico. También hay grados anisocitosis. No es lo mismo decir que tenga 78 fL, a decir que tiene 50 fL, hay mucha variación y dentro de estos (microcitico, normocitico, o macrocitico) hay niveles: leve, moderado, intenso. Por ejemplo, un paciente que tiene consumo de alcohol regular va a tener una macrocitosis de 100-110 fL, a diferencia de un paciente que tiene VIH donde en tratamiento produce una macrocitosis mucho más aberrante de 130 fL y eso condiciona el tratamiento; si se tiene más de 120 fL en el hemograma el tratamiento anti retroviral para el paciente con VIH se suspende, por eso hay que tener claro si lo que se está buscando son glóbulos rojos, son macro plaquetas o están pasando aglutinados.

Aquí aparece lo que uno informa básicamente, en la diferencia de tamaño el RDW o ADE (amplitud de distribución eritocitaria) en desviación estándar (SD) en este caso, pero lo que uno informa, de hecho lo que tiene los preliminares de los hemogramas que hemos levantado hasta ahora, se darán cuenta que estarán los dos datos, el RDW-SD y el RDW-CV (coeficiente de variación) este es el que informamos nosotros a través de la formula. La única forma de obtener este parámetro (que es muy importante porque permite hacer diferencial entre anemia ferropénica y talasemia) es a través de un contador automatizado, no se puede hacer manual, ya que no puedo medir los elementos para contarlos de uno en uno.

La anisocitosis entonces refleja la diferencia de tamaño y en algunos casos va a ser muy relevante ver si están normales y pequeños, o todos pequeños, o todos grandes, etc. y con tendencia a la microcitosis o a la macrocitosis. Fórmulas de contantes hematológicas VCM

HCM

CHCM

Estos valores son muy dependientes del hematocrito, porque con lo que se está trabajando en el laboratorio es algo manual, por eso siempre van a dar valores de contantes hematológicas diferentes en comparación con el hematocrito automatizado, porque cuando se realiza manualmente existe el concepto del plasma atrapado, siempre el hematocrito manual va a ser más alto que el hematocrito automatizado; un 2-3% más alto. Por eso esto condiciona inmediatamente el VCM. Si el hematocrito es mayor el VCM de un hemograma manual va a ser mayor, en el caso del CHCM cuando el hematocrito está bajo el CHCM será menor que el hematocrito de un equipo automatizado. Existen estos histogramas que aparecen en el equipo, que indican cual es la dispersión de los glóbulos rojos. Esto es una campana de Gauss normal, en donde entrega el valor del VCM y el promedio. Si esta macrocitico se observa que se desplaza hacia la derecha el histograma, y también se nota que tiene anisocitosis porque el ancho de la curva también es mayor. (Lo siento, no encontré la imagen) En este caso tenemos doble pick, por lo tanto hay que analizar. Todos los histogramas que salgan "extraños" se tienen que analizar el frotis necesariamente, tiene que ver la serie roja. En este caso un paciente con tratamiento con fierro, un paciente con anemia ferropénica, esta patología tiene mucha anisocitosis, por lo que va de un rango normal hacia lo microcitico, por que no se puede producir la hemoglobina, ya que parte de la hemoglobina es utilizar fierro para poder llenar el glóbulo rojo con hemoglobina, por lo tanto si no tengo fierro no lo puedo llenar y se va volviendo cada vez más chiquitito, por lo tanto la curva se va a ir hacia la izquierda y va a ser ancha. Ahora, si al paciente se le diagnostica finalmente con anemia ferropénica y se le empieza a dar fierro lo que va a ocurrir en poco tiempo, una o dos semanas,

(por lo general se equilibra en tres meses) aparecen glóbulos rojos normales y ahí uno sabe que el tratamiento es efectivo; hay una doble población, por lo tanto la anisocitosis aquí son muy importantes, por ejemplo 30%, una anisocitosis bien alta. Aquí existe una etapa en donde va afectando varias cosas, por ejemplo: Distribución de los eritrocitos con el volumen corpuscular medio: -

Cuando se tiene el ADE normal y el VCM bajo (microcitico, son todos del mismo tamaño, nos e tiene aniso) indica talasemia menor. Si tengo el ADE aumentado y el VCM disminuido, indica anemia por deficiencia de hierro, talasemia, pero mayor; puede ser hemolisis con el linfocito. Entonces, la anemia blastica, ferropénica, anemias de enfermedades crónicas que es la más común hoy en día la van a ir ustedes estudiando de a poco, el cómo se producen y como se refleja en el hemograma.

Hay que tener ojo también con los interferentes, es importante analizar los resultados que entregan el contador, por lo tanto hay que buscar por ejemplo: Pseudoeritrocitosis  Pseudo aumento de los glóbulos rojos.  Leucocitosis severa. Puede ocurrir cuando se tiene una leucocitosis severa. Cuando hay un aumento aberrante, es decir, una hiper leucocitosis (> a 100.000 leucocitos) por ejemplo, en una leucemia linfocítica crónica, en donde el linfocito tiene un tamaño similar al glóbulo rojo, el equipo puede confundirse entre tantos elementos y puede contar algunos elementos como glóbulo rojo, por lo tanto dará un falso aumento. Por lo tanto, las constante hematológicas que utilizan el recuento de glóbulos rojos como el VCM y HCM van a dar alterado.  Plaquetas gigantes. En el caso de las plaquetas gigantes, que es distinto a una macro plaqueta. Una macro plaqueta es una plaqueta más grande pero más pequeña que un glóbulo rojo, y una plaqueta gigante en más grande que un glóbulo rojo. También puede pasar como en el caso de una síndrome de Bernand-Soulier, puede pasar como un glóbulo rojo macrocitico, pero aparece lo que es el enfoque hidrodinámico, esto quiere decir que los contadores más modernos hoy en día, además de hacer una dilución y contarlos de forma automatizada agregan otro reactivo para generar un flujo unilateral, como una corriente y no se devuelven los elementos, por lo tanto, es menos probable contar plaquetas gigantes o plaquetas normales dos veces, cosa que pasaba antiguamente, porque si bien la abertura tiene un tamaño estable aproximadamente 300 - 800 fL, es grande para un glóbulo rojo o para una plaqueta es mucho mayor; si hay turbidez en el flujo se puede contar varias veces el mismo elemento, eso se evita con equipos que tengan un enfoque hidrodinámico. Si compran o necesitan un contador hematológico, dentro de las características que deberían solicitar es que tenga este enfoque.  Criofibrinógeno. Esto es un precipitado del fibrinógeno cuando hay una inflamación (el fibrinógeno es un reactante en fase aguda positivo), este fibrinógeno aumenta y creopricipita, o sea, sale de la vena y por el microambiente se aglutina y forma un precipitado, un cumulo de fibrinógeno que el equipo lo puede entender como un glóbulo rojo. En clínica, son unos sueros densos que pueden tapar la aguja y no hay forma de sacarlo, la única forma es ultracentrifugar, es como si hubiera un coagulo en el suero.  Las constantes que se ven alteradas son: VCM, hematocrito, ADE, y HCM. Pseudoeritrocitemia  

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Es la disminución de los glóbulos rojos. Crioglobulinas. La pseudoeritrocitemia se puede dar por las crioglobulinas o crioaglutininas, son un tipo de anticuerpo que se activa cuando sale la muestra de la vena, baja la temperatura necesariamente, se activa ese anticuerpo y aglutina todo, aglutina glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos. Como se está viendo glóbulos rojos, un glóbulo rojo va a pasar como uno solo por lo tanto va a ver macrocitosis, y va a haber un recuento de glóbulos rojos disminuido, por lo tanto las constantes también van a verse alteradas. Eritrocitos pequeños. Existen algunos eritrocitos muy pequeños de 35-40 fL en el caso de la talasemia que pueden ser contados como plaqueta por lo tanto puede tener trombocitosis y anemia.

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Deportistas. Existe el hemograma de los deportistas, en algunos seminarios se han visto hemograma de recién nacido, de lactante, de adulto joven, y adulto mayor; y también, existe un hemograma para el deportista. No es lo mismo hacer deporte regular a ser un deportista de alto rendimiento, ya que los corredores de fondo tienen una hemodilución falsa, por lo tanto si esta hemodiluido falsamente van a tener recuentos de glóbulos rojos diluidos. En el ministerio del deporte viene un laboratorio con rango de referencia exclusivo para deportistas de alto rendimiento. Crioglutininas

En un paciente normal no hay ningún problema. En el caso de un paciente con hemoaglutinación, los glóbulos rojos forman un verdadero acumulo y lo leuco también se aglutinan, por lo tanto, un hemograma con crioglutinina se altera completamente, y eso no se puede validar. La tinción de un paciente con crioglutinina y la muestra se ve espesa y turbia; no se puede validar. En un SAR pasa de largo, se válida y se envía, pero en el hospital hay que calentar la muestra a 37°C, hay que llevarla a la estufa o calentarla directamente sobre el flujo de agua hasta que se normalice el CHCM, esto indica que esta lista la muestra para poder validarlo, porque el CHCM nunca puede ser mayor a 36., salvo algunas excepciones. Histograma de leucocitos Es conveniente conocer la gráfica de distribución de los leucocitos, la cual es un poco diferente, no es una campana de gauss sino que tiene distintos pick y valles, porque los leucocitos tienen diferente tamaño. Cada uno de los pick representa a una población. - El principio descansa sobre el estudio volumétrico de los leucocitos tras la adición de un reactivo lítico. Básicamente lo que está diciendo después de contar los glóbulos rojos, se añade un reactivo que permite lisar todo eso y ver solamente leucocitos. Como habíamos visto, el Stomato Laser 420, el reactivo que permite lisar glóbulos rojos, todos los contadores hematológicos tienen eso, un reactivo lisante de glóbulos rojos. Posibles errores e interferentes en leucocitos.  Que hayan eritrocitos inmaduros o eritoblastos. Si pasa un eritoblasto (que tiene núcleo obviamente) por el canal el equipo lo contra como leucocito. Producirá un falso aumento.  Existen eritrocitos jóvenes, saben que los glóbulos rojos se recambian todos los días, los cuales duran aproximadamente 120 días cada glóbulo rojo, por lo tanto los eritrocitos nuevos en un hemograma sometidos a un reactivo lisante va a poder resistir y no se romperá, por lo que el equipo lo contara como un leucocito.  Existe un tipo de leucemia que se llama mieloma multiple en donde se produce mucha inmunoglobulina, esta inmunoglobulina pueden precipitar y formar cúmulos de estas proteínas que pueden contarse como glóbulo rojo o como leucocito dependiendo del tamaño.  Existen leucemias en general que lo que producen es un pseudo recuento bajo de glóbulos rojos por que el leucocito se rompe frágilmente. (en hematología 2 verán las sombras de Grumprecht que es un linfocito normal que cuando se hace extensión se rompe y lo mismo cuando se hace pasar por un contador hematológico). Por lo tanto, el recuento de leucocito dará falsamente disminuido.  La quimioterapia produce el mismo efecto sobre los glóbulos rojos y sobre los leucocitos. Desestabiliza la membrana, con esto se quiere inhibir los recuentos de leuco por lo tanto también algunas sustancias citotóxicas van a romper el leuco al momento de medir.

 Los microcoagulos. A veces hay muestras que son de punción traumática, se coagula ahí mismo de repente, sacan el coagulo y mandan esa muestra al laboratorio, una muestra que se tiene que analizar e intentar adivinar si es que estuvo coagulado o no. Hay equipos que detectan si hay microcoagulos, da una alarma; pero es el los equipos de menor gamma en donde se tiene que ver necesariamente el frotis, y en este buscar la agregación de plaquetas, estos microcoagulos, y si es así el recuento de plaquetas no se puede informar y el VPM (Volumen plaqueta medio) tampoco, (es lo mismo que el VCM ero en las plaquetas) que pueden ser consideradas como un leucocito en el recuento de leuco, por lo tanto tampoco se podría informar los leucos. Alarmas leucocitarias Aquí aparecen las distintas poblaciones: L1: es la primera porción. Aumento anormal de células entre los 30 a 50 fL. Si hay un pick al comienzo sospechar de plaquetas agregadas o eritoblastos. M2: Aumento anormal de células entre los 130 a 160 fL. Sospechar de linfoblastos (elementos muy inmaduros), mielocitos, linfocitos atípicos o basofilia. G1: Entre 160 y 220 fL. Sospechar de eosinofilia, mielocitos. G2: Se corre el pic de granulocitos. Revisar reactivo. G3: Mayor a 400 fL. Sospechar de juveniles. Parámetros -

Los parámetros medidos por un contador hematológicos son:  Eritrocitos (RBC)  Leucocitos (WBC)  Plaquetas (PLT)  Hemoglobina (Hgb)

Tiene un canal para contar glóbulos rojos y plaquetas. Tiene un segundo canal para contar leucocitos después que le añade un reactivo lisante. Tiene un tercer canal para determinar la hemoglobina (a una longitud de onda de 535 o 540 nm) -

Los parámetros derivados de las mediciones de volumen:  Volumen corpuscular medio (VCM)  Ancho de distribución eritrocitaria (ADE)  Volumen plaquetario medio (VPM)

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Los parámetros calculados son:  Hematocrito (Hct)  Hemoglobina corpuscular media (HCM)  Concentración corpuscular med...