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una clase de crisprcas9...

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Marwane Bourqqia

TATO – CRISPER-CAS

Edición genómica con CRISPERCAS9: aplicaciones en el cáncer [email protected] El cáncer es una enfermedad genética originada por alteraciones en el genoma de las células cancerosas. Ej: La leucemia es un reordenamiento entre el cromosoma 9 y 2 generando genes de fusión. El nobel de este año se ha otorgado a las que aplicaron el sistema CRISPER-CAS para la edición genómica en el 2012 y desde entonces se ha empleado esta técnica para la edición de genomas. El estudio del fenotipo y genotipo de los individuos se ha realizado de forma clásica por medio de la genética directa, donde a partir de un fenotipo se busca el genotipo asociado, pero también se puede estudiar por medio de la genética inversa. Esta estudia es el genotipo para conocer que fenotipo genera, para ello se inducen alteraciones en el genoma y si visualizan los fenotipos resultante. La ingeniería genómica busca producir modificaciones en el genoma de forma dirigida. Las técnicas clásicas generaban alteraciones altamente precisas, pero extremadamente ineficientes (una eficiencia del 10-6, porque normalmente la combinación ocurre en sitios aleatorios y no en el sitio deseado) y costosas. Para ello se introduce el DNA exógeno con brazos de homología en interior de la célula. Esto va a producir que los brazos localicen la región que queremos modificar y por recombinación homologa se va a realizar un intercambio de las secuencias de tal modo que podemos introducir un cambio en esa región concreta. Se ha visto que si se realiza un corte en las dos hebras del DNA exógeno y DNA del organismo la eficiencia mejora notablemente. Cuando generamos un corte en el genoma la célula lo detecta y al intentar repararlo introduce la modificación del genoma. Para ello nos aprovechamos de los sistema de reparación del DNA: -

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NHEJ: es el que utiliza la mayoría de las veces, que es cuando detecta un corte y no tiene ningún molde para repararlo, pegando los trozos para ello introduce indels. Que son pequeñas inserciones o delecciones de secuencias para permitir el solapado de nuevo del corte. Este tipo de reparación se emplea para generar Knock-out de un gen, para eliminar un gen o silenciarlo, para así poder estudiar la funcionalidad del gen al estudiar los efectos que se producen cuando no se expresa. Homology directive repair: que es el que se emplea cunado la célula tienen un molde en el que basarse. Entonces si además de la rotura introducimos un DNA exógeno con

Máster Biotecnología UCM – Sandra Rodríguez Perales

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brazos de homología lo que va a hacer que la célula utilice el DNA exógeno para reparar el DNA endógeno, introduciendo nuestra secuencia deseada.

Máster Biotecnología UCM – Sandra Rodríguez Perales

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Por ello se han empezado a desarrollar diferentes herramientas para realizar los cortes en las moléculas de DNA. Estas herramientas se denominan nucleasas modificadas y existen diversos tipos: -

Zinc Finger: sistema artificial que se genera uniendo una enzima que produce roturas en el DNA con una serie de dominios que tienen homología por trinucleotidos al DNA (se suelen poner para detectar 9, 12, 15 o 18 pb), dependiendo de los dominios que tengamos unidos a la enzima de restricción podremos dirigir la enzima de restricción al lugar de corte deseado. Este sistema esta compuesto de dos elementos, porque cada enzima de restricción solo puede realizar corte en una hebra así que necesitamos dos Zinc-Finger para cada corte. o Ventajas: cada uno de los dos elementos tiene un tamaño aceptable, así que lo puedo emplear para modificar un virus y luego emplear este para modificar las células. o Desventajas: los tripletes de homología no se generan de un modo sencillo, se precisan dos elementos (si ya es difícil meter un único sistema para cortar, imagina tener que meter dos y que además estén coordinados entres si para cortar en el mismo punto, cada uno en una hebra), tiene efectos off-target (puede cortar en sitios nos deseados) y ya para rematar es una técnica patentada así que hay que pagar para poder trabajar con ella.

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TALEN: tecnología similar a las anteriores a diferencia de que reconoce nucleótidos en lugar de trinucleotidos (se emplean secuencias de 33-35 nucleótidos en el reconocimiento). o Ventajas: no está patentada y no es difícil de diseñar, así que podemos comprar los nucleótidos y diseñarlo nosotros mismos en el laboratorio. o Desventajas: sigue precisando dos elementos, porque cada nucelasa realiza el corte en una sola hebra, tiene cierta dificultad para ensamblar el complejo, no funciona con organismos con elevado contenido en G-C y presenta off-target.

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CRISPER: es un sistema muy fácil de diseñar y de producir de forma autónoma en el laboratorio. La principal diferencia que presenta con los anteriores modelos es que la homología con la región del DNA a cortar viene dada por una molécula de RNA de cadena sencilla (reconoce 20pb) y no por una proteína (Es mucho más fácil sintetizar una molécula de RNA que hacer ingeniería proteica para conseguir localizar la proteína deseada). Es una tecnología de uso libre en laboratorios, pero no para empresas. En este sistema tenemos dos regiones diferentes, por un lado, la nucleasa CAS (genera un corte en las dos hebras de DNA) y el RNA guía. o Ventajas: Se trata de un técnica fácil y barata de desarrollar, que la patente permite un desarrollo gratuito para ensayos científicos, solo se emplea una nucleasa para hacer corte en las dos hebras y que se puede aplicar en cualquier organismo. o Desventajas: Es un complejo de gran tamaño y puede presentar off-targets.

Sistema CRISPER: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Es un Sistema de inmunidad adaptativo, que emplean bacterias y arqueas para defenderse de infecciones. Donde tenemos dos complejos génicos -

CRISPER array: son secuencias de DNA denominadas spacer (con número y color) que están separadas por otras secuencias repetidas (regiones grises entre las spacer). Genes asociados: genes que trabajan en este sistema, entre ellos los codificantes para la endonucleasa

Los spacer corresponden con secuencias de virus que atacan a esas bacterias. De tal modo que cuando un virus ataca una bacterias introduce su genoma dentro de al bacteria y la bacteria se guarda unas secuencias de su genoma (el spacer). Cuando esta bacteria o su descendencia vuelve a ser atacada por este virus, el locus se expresa generando un RNA que se une con los genes asociados, formando el complejo Ribonucleoprotein. El RNA guía tiene un fragmento que es homologo al genoma del virus, de tal modo que cuando hibridan se introducen cortes en el genoma del virus degradándolo.

Este sistema se describió en 1987, pero no fue hasta 2012 que se usó para la modificación genética que se hizo viral. En 2013 aparecido el primer artículo científico que emplea esta técnica para realizar cambios reales en células de mamíferos.

En el artículo del 2012, lo que se demostró es que, si modificamos las secuencias spacer, para hacerlas complementarias a aquellas regiones del DNA que querremos cortar (debe tener una longitud de 20pb), podemos realizar dirigir la endonucleasa CAS a cualquier punto. De tal modo que una vez que se une el RNA guía con la nucleasa, empieza a escanear el DNA hasta que encuentra una secuencia PAM (3 nucleotidos, 5'-NGG-3 'donde "N" es cualquier nucleótido). Entonces para y chequea si hay homología ente RNA guía y la región que está al lado de la secuencia PAM.

Si no hay homología, el complejo sigue escaneando el DNA hasta que encuentre otro punto PAM para volver a comprobar la homología. Cuando encuentra un punto con homología, la nucleasa sufre un cambio conformacional, que le permite realizar un corte en la doble hebra de DNA. Esta rotura se produce siempre en los 3 nucleótidos anteriores a la secuencia PAM. Si no introducimos un DNA además de realiza a NHEJ lo que va a provocar un silenciamiento del gen donde se ha realizado el corte. Si en cambio introducimos un DNA, la célula seguirá la vía Homology directive repair, introduciendo el DNA en el genoma (podemos meter DNA a la carta en el genoma) De los 20 nucleótidos que tiene el RNA guía, no todos son igual de importantes a la hora de localizar la homología, por lo que hay nucleótidos que tienen que ser iguales y otros que pueden variar, generando Off-targets (En esta foto el tamaño del nucleótido nos indica como de exacto tiene que ser la homología entre la secuencia guía y la secuencia del DNA).

Dentro de la célula hay que meter el RNA guía y la CAS9. Para ello se pueden emplear diferentes métodos: -

CAS 9: proteína o por una línea estable con una virus que me produzc la CAS 9 o por un plásmido Guia: en formato de RNA, de plásmido doble …

Hay sistemas de CRISPER-CAS, que no realizan cortes en la región, sino que solo la localizan, de tal modo que nos permite numerosas aplicaciones (además de las de aquí abajo, podemos emplear el CRISPER-CAS para generar biocombustibles, organismos transgénicos …) -

Si se une con una proteína fosforescente podemos marcar nuestra secuencia y localizar en que tejidos se expresa. Si se une con una región moduladora puedo activar o silenciar genes.

En el caso de las investigaciones médicas, podemos emplear el sistema CRISPER: -

Estudiando la funcionalidad generando Konw-out Generar mutaciones y ver cual es el efecto de estas Hacer ensayos para descubrir nuevas dianas terapeúticas

Aplicaciones terapéuticas contra el cáncer. Para aplicar CRISPER, se puede realizar tratamientos: -

Exvivo: trabajando con las células del paciente fuera de su organismos y luego se las devuelvo Envivo: aplico CRISPER directamente sobre el paciente. Esta metodología es mucho más complicada y puede tener asociado mas off-target. En febrero del 2020 salió una estudio en fase 1. Se vio que el efecto off-target que había solo aparecían dentro de las células tratadas y no afectaban a la salud de los individuos.

una via terapéutica es seleccionar los genes de fusión, que provocan el cancer. Actualmente hay 10 ensayos clínicos activos en el mundo...