Detección de bacterias patógenas en pulque PDF

Preview

Summary

Proyecto final para acreditar la materia de inmunologia, deteccion de bacterias patogenas en bebida tradicional mexicana "pulque"...

Description

Detección de E. coli O157:H7 y Salmonella typhimurium en la bebida tradicional Mexicana “Pulque” por el método de inmunoensayo de flujo lateral para asegurar su inocuidad.

INTRODUCCIÓN EL PULQUE El pulque es una bebida tradicional Mexicana que se obtiene por la fermentación de la savia azucarada conocida como aguamiel obtenida a partir de diferentes especies de maguey (Agave americana, A. atrovirens, A. feroz, A. mapisaga, A. salmiana). Esta bebida es elaborada y consumida por poblaciones indígenas y mestizas de muchas regiones de México, particularmente en las áreas de la meseta central ( Ciudad de México, estado de México, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Michoacán, Morelos, Oaxaca, Puebla, Querétaro, San Luis Potosí, Guadalajara, Tlaxcala y Veracruz.). Se caracteriza por ser una bebida alcohólica, blanca, con olor fuerte y viscosa.

(Figura I. Bebida tradicional “pulque”)

(Figura II. Maguey)

El proceso de fermentación inicia en el maguey, donde se encuentran microorganismos autóctonos como levaduras, bacterias lácticas, bacterias productoras de etanol y bacterias productoras de exopolisacaridos. Estos microorganismos transforman de manera natural parte de los azúcares disponibles en aguamiel, sin embargo el proceso se acelera por la adición de un inóculo iniciador llamado semilla (una porción de pulque previamente producido). El tiempo de fermentación puede durar de 12 a 48 horas a 25º C, cuidando que los recipientes no tenga ninguna sustancia que inhiba los microorganismos mesofílicos (Detergentes, perfumes, desinfectantes, entre otros). A medida que pasa el tiempo se presentan cambios importantes como un incremento en el porcentaje de etanol y formación de exopolisacaridos como b-glucanos y dextranos. La literatura reporta que a partir del pulque se pueden recuperar diversos grupos microbianos clasificados como: subdivisión Bacillus-

Lactobacillus-Streptococcus (Lactobacillus cepa ASF360 AF157050, Lactobacillus acidophilus, M99740, L. hilgardii M58521, L. plantarum D79210 y Leuconostoc mesenteroides spp mesenteroides), subdivisión proteobacteria (Acetobacter pomorium AJ001632, Zymomonas mobilis AF281034) y hongos levaduriformes pertenecientes a los géneros (Sacharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp). [1]

(Figura III. Árbol filogenético de secuencias de ADNr 16S únicas detectadas en aguamiel y muestras de pulque) [Escalante A. (2008)] [2]

Los alimentos pueden contener microorganismos o metabolitos patógenos que afectan en el consumo del hombre provocando enfermedades. Éste problema es derivado a la ingesta de alimentos de baja calidad sanitaria. Si bien no genera un problema de mortalidad significativo, afecta a una gran población por enfermedades caracterizadas por causar diarreas, dolores abdominales, vómitos, náuseas, etc.

En un proceso fermentativo donde la caída de pH es consecuente no es obstáculo para la proliferación de microorganismos de naturaleza patogena; es por ello de suma importancia implementar herramientas que nos faciliten una regulación y aseguramiento de los estándares de calidad de acuerdo a la norma de producción e inocuidad de alimentos y bebidas [3] .

E. coli O157 H:7 Escherichia coli es un bastón Gramnegativo (bacilo) de la familia Enterobacteriaceae. La mayoría de las E. coli son comensales normales que se encuentran en el tracto digestivo. La Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) es un conjunto de E. coli patógenas, que puede causar diarrea o colitis hemorrágica en los humanos. En ocasiones, la colitis hemorrágica deriva en síndrome urémico hemolítico (SUH), una causa importante de insuficiencia renal aguda en niños y morbilidad y mortalidad en adultos. En los ancianos, la tasa de letalidad por el SUH puede elevarse al 50%. La E. coli O157:H7 (ECEH O157:H7) ha sido reconocida como la causa de este síndrome desde la década de 1980. Los reservorios de la ECEH O157:H7 son los rumiantes, en especial el ganado bovino y las ovejas, que se infectan sin presentar síntomas y eliminan el organismo en las heces. Las E. coli están serotipadas según los antígenos O (lipopolisacáridos somáticos), H (flagelares) y K (capsulares). Los serotipos que se conocen por contener ECEH incluyen a E. coli O157:H7, el organismo no móvil E. coli O157:H, y los miembros de otros serogrupos. Las epidemias de ECEH O157:H7 de origen alimentario generalmente son causadas por la ingesta de productos de origen animal mal cocidos o no pasteurizados, en especial, carne molida pero también otras carnes y embutidos, y leche y queso no pasteurizados. [4] Salmonella typhimurium Salmonella typhimurium es una bacteria gramnegativa patógena que se encuentra predominantemente en la lumen intestinal. Su toxicidad se debe a una membrana externa que consiste principalmente en lipopolisacáridos (LPS) que protegen a las bacterias del medio ambiente. El LPS está compuesto de un O-antígeno, un núcleo de polisacárido y un lípido A, que lo conecta a la membrana externa. El lípido A está formado por dos glucosaminas fosforiladas que están unidas a los ácidos grasos. Estos grupos fosfato determinan la toxicidad bacteriana. Los animales portan una enzima que elimina específicamente estos grupos fosfato en un intento de protegerse de estos patógenos. El O-antígeno, que se encuentra en la parte más externa del complejo LPS, es responsable de la respuesta inmune del huésped. S. typhimurium tiene la capacidad de someterse a la acetilación de este Oantígeno, que cambia su conformación, y hace que sea difícil para los anticuerpos reconocer. Hasta hace poco, la causa más común de intoxicación alimentaria por especies de Salmonella se debía a S. Typhimurium. Como su nombre indica, causa una enfermedad similar a la tifoidea en ratones. En humanos, S. Typhimurium no causa una enfermedad tan grave como S. Typhi, y normalmente no es mortal. La enfermedad se caracteriza por diarrea, calambres abdominales, vómitos y náuseas, y generalmente dura hasta 7 días.

Desafortunadamente, en las personas inmunocomprometidas, es decir, los ancianos, los jóvenes o las personas con sistemas inmunológicos deprimidos, las infecciones por Salmonella a menudo son mortales si no se tratan con antibióticos. [5] (Tabla I. Etiologías de las gastroenteritis en diversos grupos de población [10] )

(Figura IV. E. coli H:7 O157)

(Figura V. Salmonella typhimurium)

INMUNOENSAYO DE FLUJO LATERAL Un inmunoensayo es un conjunto de técnicas donde en base a la especificidad y afinidad de conjugaciones entre antígenos y anticuerpos en conjunto con marcadores, se lleva a cabo una reacción que da prueba a la presencia de moléculas específicas. Éste método permite una identificación de gran sensibilidad en líquidos orgánicos o compuestos de concentraciones reducidas, además que se destaca por ser un método simple y rápido.

El principio detrás del inmunoensayo de flujo lateral consta de una muestra líquida que contenga el analito de interés, ésta muestra por acción capilar es transportada a través de tiras poliméricas (almohadillas) como puede ser nitrocelulosa, donde se encuentran componentes biológicos específicos (antígenos o anticuerpos) inmovilizados que interaccionarán con el analito objetivo. La muestra se aplica en una almohadilla externa acondicionada con buffer para asegurar una correcta interacción de los analitos. La muestra migra a través de la almohadilla que contiene anticuerpos o antígenos específicos del analito objetivo conjugados con moléculas coloreadas o fluorescentes, comúnmente microesferas de oro y látex coloidales. La muestra en conjunto con el anticuerpo migran a la zona de detección donde ocurre un reconocimiento de interacciones con la aparición de líneas coloreadas que se pueden evaluar a simple vista, en la línea de control se confirma que el flujo del líquido a través de la tira fué apropiado, la línea de prueba se observa la detección de las interacciones. [6] ANTICUERPOS Anti-Salmonella typhimurium LPS antibody [1E6] (ab65922). Objetivo: El género Salmonella es un miembro de la familia Enterobacteriaceae. El género está compuesto de bacilos gramnegativos que son facultativos y flagelados (móviles). Salmonella posee 3 antígenos de superficie principales; el antígeno H o flagelar (fase 1 y 2), el antígeno O o somático (parte del resto LPS) y el antígeno Vi o capsular (denominado K en otras enterobacteriáceas). Las Salmonella también poseen la endotoxina LPS característica de las bacterias Gram negativas. Este LPS está compuesto de un polisacárido O (antígeno O) y un núcleo R y el lípido A endotóxico interno. Las endotoxinas provocan fiebre y pueden activar el complemento, la cinética y los factores de coagulación. Descripción: Ratón monoclonal [1E6] a Salmonella typhimurium LPS. Especificidad: ab65922 detecta Salmonella typhimurium LPS en cultivos bacterianos y muestras. Reactividad: Bacteria Inmunógeno: LPS de S. typhimurium. Instrucciones de almacenamiento: Enviado a 4 ° C. En la alícuota de entrega y almacenar a -20 ° C. Evite ciclos de congelación / descongelación. Buffer: Conservante: Azida sódica al 0.09% Constituyentes: PBS, pH 7.2 Numero de clon: 1E6 Isotipo: igG1 [7]

Anti-E. anticuerpo coli O157 [3011] (ab20976). Objetivo: Escherichia coli es una bacteria Gram negativa que se encuentra comúnmente en el intestino grueso de organismos de sangre caliente (endotermos).Sus tipos serológicos se determinan en combinación con antígenos somáticos (grupo O: O1-O173) y antígenos flagelares (tipo H: H1-H56).Las E. coli que causan enfermedades infecciosas intestinales que incluyen diarrea, gastritis aguda o colitis se conocen como E. coli patógena, que se clasifican en los siguientes 4 grupos de acuerdo con las diferencias en el modo de patogenicidad;E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC) y E. coli enterohemorrágica (EHEC).Aunque la identificación de E. coli patógena requiere la verificación de su patogenicidad, la E. coli patógena a menudo tiene serotipos específicos;por lo tanto, es necesario el tipaje del serogrupo y el serotipo en la detección de E. coli patógena. Descripción: Ratón monoclonal [3011] a E. coli O157 Especificidad: Específico para E. coli serotipo O157. La región reconocida por este anticuerpo es oligosacárido LPS. No reactivo con serotipos: O111, O125, O20 y O55 y K12. Reactividad: Escherichia coli. Inmunógeno: E. coli 0157 células enteras. Buffer: Conservante: azida sódica al 0,1% Componentes: 10 mM de PBS, pH 7.2 Número de clon: 3011 Isotipo: IgG3 [8,9]

Anticuerpo policlonal para salmonella typhimurium Objetivo: El género Salmonella es un miembro de la familia Enterobacteriaceae. El género está compuesto de bacilos gramnegativos que son facultativos y flagelados (móviles). Salmonella posee 3 antígenos de superficie principales; el antígeno H o flagelar (fase 1 y 2), el antígeno O somático (parte del resto LPS) y el antígeno Vi o capsular (denominado K en otras enterobacteriáceas). Las Salmonella también poseen la endotoxina LPS característica de las bacterias Gram negativas. Este LPS está compuesto de un polisacárido O (antígeno O) y un núcleo R y el lípido A endotóxico interno. Las endotoxinas provocan fiebre y pueden activar el complemento, la cinética y los factores de coagulación. Especies reactivas probadas: Bacteria

Especies reactivas publicadas: Bacteria Hospedero / Isotipo: Conejo / IgG Clase: Policlonal Tipo: Anticuerpo Immunogeno: Mezcla de S. enteriditis, S. typhimurium y S. heidelburg. Conjugado: No conjugado Forma: Liquido Concentración: 4 mg/ml Purificación: Fracción IgG Buffer de almacenamiento: PBS, pH 7.2 Contiene: 0.1% azida de sodio Condiciones de almacenaje:Almacenar a 4°C para periodos cortos. Para almacenaje de largos periodos, conservar a -20°C. RRID: AB_561199 [10]

Anticuerpo policlonal para e. coli O157 H:7 Objetivo: Escherichia coli es una bacteria Gram negativa que se encuentra comúnmente en el intestino delgado de organismos de sangre caliente (endotermos). Sus tipos serológicos se determinan en combinación con antígenos somáticos (grupo O: O1-O173) y antígenos flagelares (tipo H: H1-H56). Las E. coli que causan enfermedades infecciosas intestinales que incluyen diarrea, gastritis aguda o colitis se conocen como E. coli patógena, que se clasifican en los siguientes 4 grupos de acuerdo con las diferencias en el modo de patogenicidad; E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC) y E. coli enterohemorrágica (EHEC). Aunque la identificación de E. coli patógena requiere la verificación de su patogenicidad, la E. coli patógena a menudo tiene serotipos específicos; por lo tanto, es necesario el tipaje del serogrupo y el serotipo en la detección de E. coli patógena. Forma: Instrucciones de almacenamiento: Almacenar a + 4 semanas). A largo plazo almacenar a -20 ° C o -80 congelación / Buffer de almacenamiento: 0.1% Constituyentes: 40% de Concentración:200 μg a 5.5 Purity: Proteína G Clonalidad: Isotipo: IgG [11]

Líquido ° C a corto plazo (1-2 ° C. Evite el ciclo de descongelación. Sodium Azide glicerol, PBS mg / ml purificada policlonal

NORMAS La Norma Oficial Mexicana que controla la producción e inocuidad de alimentos y bebidas es la norma oficial mexicana NOM-120-SSA1-1994: Bienes y servicios, prácticas de higiene y sanidad para el proceso de alimentos, bebidas no alcohólicas y alcohólicas. Ante la continua presencia de enfermedades transmitidas por alimentos y bebidas, el surgimiento de más patógenos emergentes como todas las E. coli enterohemorrágicas además de la E.coli O157:H7 y otros grupos bacterianos como el género Salmonella , el Sistema Federal de Salud por medio de COFEPRIS decretó en diciembre del 2009, la NOM-251-SSA1-2009: Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios, que entró en vigor oficial desde septiembre del 2010. [12] Sin embargo, todas estas normas de salubridad de alimentos tienen muchas especificidades para diferentes tipos de alimentos, en los que en ninguna hace referencia a bebidas fermentadas alcohólicas, y mucho menos al pulque, es decir no hay una metodología para garantizar la inocuidad de este, nisiquiera en la Norma Mexicana NMX-V-022-1972., para aguamiel, que específicamente habla sobre cómo producir esta bebida no tiene como un control o chequeo necesario para garantizar la seguridad del producto. Asimismo se aplicará la NORMA Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos., en caso de que el pulque analizado diera positivo con el inmunoensayo se procederá a aplicar esta norma y determinar si tiene o no el número de coliformes totales para salir a mercado.

JUSTIFICACIÓN En México existe una gran variedad de alimentos y bebidas que son producidos y consumidos en los diferentes estados del país, estos alimentos producidos en un solo estado son considerados como “típicos”. Algunos otros alimentos son producidos en varios estados del país y se han vuelto representativos de toda una región. Sin embargo, independientemente del origen o características de este tipo de alimentos, prácticamente no existe información relacionada con su inocuidad, por ejemplo, no se conoce cuál es la frecuencia de microorganismos patógenos en tales alimentos, qué tipos se pueden encontrar asociados a éstos, su comportamiento, ni hay registros de brotes asociados a su consumo [3]. Los sistemas de producción de alimentos típicos son principalmente artesanales, con condiciones de higiene inadecuadas y exposición a múltiples fuentes de contaminación. Tal es el caso del pulque que casi no existen datos sobre la seguridad microbiológica y el comportamiento de microorganismos patógenos en néctar de agave [1] La diversidad de bacterias en aguamiel al final del proceso de fermentación, está compuesta principalmente por el homofermentativo Lactobacillus

acidophilus, el heterofermentativo L. mesenteroides, Lactococcus lactis subsp. lactis y la α-Proteobacteria A. malorum, lo que demuestra la presencia de metabolitos homo y heterofermentativos, acéticos y alcohólicos en el producto final (9). Sin embargo el proceso fermentativo donde la caída de pH es consecuente, no es un obstáculo para ciertos microorganismos que toleran variaciones de pH puedan sobrevivir, tal es el caso de brotes de enfermedades por S. Typhimurium y E.coli O157:H7 en sidra [4, 5] Lo ocurrido en este brote con 23 personas afectadas radica en que la sidra se obtiene por fermentación maloláctica del jugo de manzana que da lugar a una caída en el pH cercana a 4.0. Investigaciones sobre ácido-tolerancia y adaptación ácida en patógenos como E. coli O157:H7 y S. Typhimurium han demostrado la capacidad que tienen estos para sobrevivir y adaptarse a alimentos de bajo pH como sidra y jugos de frutas [3, 6, 7, 8]. En el comportamiento de E.coli O157:H7, Salmonella Typhimurium, L. monocytognes y S.aureus durante ciclos de fermentación de pulque, la E.coli O157:H7 presento la mayor sobrevivencia y el mayor desarrollo tanto a 15° como a 22°C durante todo el ciclo de fermentación del pulque, en el que pudo sobrevivir al menos 48 horas, por lo que se sugiere que especialmente esta cepa tiene el potencial para desarrollar tolerancia a la acidez y etanol del pulque [3]. Actualmente existen métodos para la detección de patógenos en alimentos y bebidas, estos métodos van desde ensayos microbiológicos, PCR, citometría de flujo, etc. Estos ensayos ofrecen resultados confiables, pero son lentos y costosos para los productores, es por ello la necesidad de buscar nuevas técnicas de detección. La inmunodetección consiste en detectar y localizar antígenos utilizando anticuerpos que los reconozcan específicamente.

OBJETIVOS I.

General

Detección de cepas patógenas, tales como, E. coli O157 H:7 y Salmonella typhimurium en pulque por el método de inmunoensayo de flujo lateral para asegurar la inocuidad del producto. II.

Particulares   

Implementar una técnica cualitativa, rápida y de bajo costo en la detección inmunológica de dichas cepas patógenas. Implementar una alternativa para asegurar la inocuidad de la bebida tradicional pulque. Establecer los parámetros de calidad necesarios para la comercialización y exportación del producto con seguridad para el consumidor.



Restablecer la confianza a nivel local como internacional para el consumo del pulque.

METODOLOGÍA Se utilizaran dos membranas porosas de celulosa tratadas con Cu2+ que cumplan con la capacidad de transportar líquidos (el pulque) de forma espontánea, las membranas se recubrieran de plástico y se adaptaran a un solo dispositivo. Las membranas se componen por tres tipos de anticuerpos en tres zonas diferentes de la tira: la zona de reacción, zona de test, y la zona de control. Estos anticuerpos se inmovilizaran en por el método cromatografía de afinidad a quelatos metálicos inmovilizados (IMAC). En el sitio de reacción de cada membrana se inmovilizará un anticuerpo monoclonal Anti-O para Salmonella Typhimurium. Si existe S. Typhimurium en el pulque, se unirá al anticuerpo. Se realizará el mismo procedimiento en la segunda membrana para escherichia coli serotipo O157 utilizando utilizando Anti-O157 En el sitio de test de la primer membrana se inmovilizara un anticuerpo policlonal Anti-O para S. Typhimurium conjugado con un colorante (partículas de oro coloidal). Si existe S. Typhimurium, vendrá unido de la anterior zona con el anticuerpo monoclonal y reaccionará con el anticuerpo policlonal de esta zona, generando un cambio de color a rojo. Se realizará el mismo procedimiento en la segunda membrana para escherichia coli serotipo O157 utilizando Anti-O157. [12] En el sitio de control se validará que el test se ha llevado a cabo correctamente. En esta zona se encuentra un tercer anticuerpo conjugado con colorante (partículas de oro coloidal) que reacciona con los anticuerpos monoclonales libres que provienen de la zona de reacción de cada membrana, produciendo un cambio de color a rojo si el test funcionó. Para llevar a la prác...