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AISLAMIENTO, DESCRIPCION E IDENTIFICACION DE UNA BACTERIA AMBIENTAL EN LA UNIVERSIDAD DEL QUINDIO F. Emmanuel P. UNIVERSIDAD DEL QUINDIO FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y TECNOLOGIAS PROGRAMA DE BIOLOGIA RESUMEN Las bacterias habitan en todas partes, tanto dentro como fuera de nuestro cuerpo. En el med...

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AISLAMIENTO, DESCRIPCION E IDENTIFICACION DE UNA BACTERIA AMBIENTAL EN LA UNIVERSIDAD DEL QUINDIO Andrés F. Buitrago-H; Emmanuel Echeverry-C; María P. Toro-G UNIVERSIDAD DEL QUINDIO FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS Y TECNOLOGIAS PROGRAMA DE BIOLOGIA

RESUMEN Las bacterias habitan en todas partes, tanto dentro como fuera de nuestro cuerpo. En el medio ambiente, existe una gran diversidad de estos organismos microscópicos, tal variedad ha hecho que su conocimiento sea limitado, puesto que existen variedad de hábitats y condiciones en la que se pueden desarrollar. Por esto, se propuso identificar un tipo de bacteria presente en el gimnasio de la Universidad del Quindío, para tal efecto, se utilizó diferentes técnicas, basadas en características fenotípicas, empleadas en el campo de la microbiología para la identificación, tales como la descripción de las características macro de la colonia, tinciones y medios de cultivo diferenciales, y agentes inhibidores del crecimiento bacteriano. Estas pruebas arrojaron resultados que conllevaron a suponer que la identidad de la bacteria que se empleó en el estudio hace parte del género Staphylococcus. Palabras clave: bacteria, identificación, aislamiento, descripción, Staphylococcus.

INTRODUCCION Las bacterias son organismos unicelulares muy pequeños y relativamente sencillos, cuyo material genético no está rodeado por una membrana nuclear especial, por ello se llaman procariotas (Granados et al., 2003). Estos microorganismos se encuentran en todas partes. Son transportados por corrientes de aire desde la superficie de la tierra a las partes más altas de la atmósfera, abundan en donde encuentran alimento, humedad y una temperatura adecuada para su desarrollo y multiplicación. Se encuentran en el aire que respiramos y en el alimento que comemos; así mismo, sobre la superficie de nuestro cuerpo, en el conducto digestivo, en la boca, en la nariz y en otros orificios corporales (Pelczar, 1910).

Aunque algunas producen enfermedades muchas bacterias desempeñan papeles beneficiosos, participando en los ciclos de los elementos de la biosfera, la degradación de materia muerta animal y vegetal, y la producción de vitaminas (Prescott et al., 2008). Para cultivar bacterias ambientales es fundamental contar con un medio de cultivo básico, ya que permitirá obtener un ecosistema bacteriano mixto. Por otro lado, para aislar o purificar una colonia de bacterias específica, se realiza la siembra indirecta, inoculando una parte de esa colonia en un nuevo medio de cultivo estéril que podrá ser enriquecido, selectivo y/o diferencial donde sólo se desarrollará 1

la bacteria seleccionada, a excepción de cuando el medio se contamine en el momento de la siembra (Madigan et al., 2003). Actualmente, la identificación bacteriana se realiza por medio de métodos convencionales, basados en las características fenotípicas. Los métodos genotípicos suelen reservarse para las bacterias que no se pueden identificar con métodos convencionales. Los esquemas tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en las características observables de las bacterias, como su morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y metabólicas. En el cultivo es esencial la correcta elección del medio de crecimiento y las condiciones de incubación (Fernández et al., 2010). Los antibióticos son sustancias que destruyen los microorganismos de una infección producida por bacterias. Cada antibiótico es especifico y generalmente es efectivo, aunque existen casos donde la bacteria desarrolla resistencia neutralizando su efecto (Lora et al, Año).

este concurre gran cantidad de personas, para esto se realizó una siembra directa, exponiendo uno de los medios de cultivo con agar nutritivo en la entrada del establecimiento deportivo. Del cultivo mixto se seleccionó la colonia de interés a la cual se le realizó la descripción macro de los aspectos morfológicos, seguidamente se procedió al aislamiento de la colonia anteriormente mencionada, para esto se sembró indirectamente con asa bacteriológica en estría sobre la superficie del agar nutritivo para obtener un cultivo puro, y en estría por agotamiento en el agar Mac Conkey. En la anterior siembra y las siguientes se realizó un área de esterilidad y se quemó el asa al rojo vivo en la flama del mechero, antes y después de cada uso, enfriándose posteriormente en un lugar libre del medio, con el fin de evitar el crecimiento de otros microrganismos contaminantes. Estas se guardaron en la incubadora a 37° C y se observó la aparición de colonias durante su desarrollo durante una semana.

METODOLOGIA

Luego de esto se realizó tinciones diferenciales tales como: Tinción Gram y Ziehl Neelsen, y se observó en el microscopio óptico binocular Nikon en los objetivos de 40X y 100X, en este último se describió la bacteria microscópicamente atendiendo a su composición química, su forma y tipos de agrupamiento.

En primera instancia se preparó medios de cultivo enriquecido y selectivo como lo son: agar nutritivo y agar Mac Conkey, verificándose las cantidades para el volumen deseado y el pH adecuado para el crecimiento de bacterias ambientales. Estos se vertieron en 3 cajas de Petri estériles, (2 de estas con agar nutritivo y 1 con agar Mac Conkey). Se propuso como área de estudio el gimnasio de la universidad del Quindío, ubicado en el tercer piso del bloque de bienestar institucional, debido a que a

Para la caracterización detallada de microrganismos además de tener en cuenta su morfología es importante conocer su fisiología y su capacidad metabólica, para esto se llevó a cabo pruebas diagnósticas o bioquímicas en las cuales se inoculo la bacteria objeto de estudio y se ejecutó cada una de las pruebas dispuestas a continuación: Prueba TSI (Agar triple azúcar hierro), Prueba Citrato Simmons, Prueba de la urea (Agar Urea), Prueba LIA (Agar Hierro Lisina) en cada uno de estos se

De acuerdo a lo anterior se pretendió aislar, describir e identificar una bacteria ambiental presente en el gimnasio de la Universidad del Quindío, en el municipio de Armenia, Quindío.

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sembró con asa bacteriológica por estría y en tubo inclinado; del mismo modo se sembró la bacteria en Agar Sangre, del cual posteriormente se extrajo dos muestras que se diluyeron en una gota de agua destilada en cada uno de los extremos de un portaobjetos, se realizó la prueba de catalasa adicionando peróxido de hidrogeno y la prueba de oxidasa, a la que se le adiciono reactivo de Kovacs. Seguido a esto, para la prueba de motilidad (Agar SIM), se inoculó con aguja bacteriológica la muestra en el centro del medio. Acto seguido a ésta observación se agregó tres gotas de reactivo de Kovacs para la prueba del Indol. Como último paso de las pruebas bioquímicas, con el asa bacteriológica se inoculó la bacteria en medio líquido de caldo Tripticasa de Soya. Finalmente, con objeto de visualizar el efecto de distintos antibióticos (Penicilina, Gentamicina, Ampicilina y Eritromicina), y teniendo en cuenta el tubo número 5 en la escala de MacFarlan se diluyó una muestra bacteriana con agua destilada en pequeño tubo de ensayo estéril hasta que esta lograra la turbidez correspondiente. Con un hisopo estéril se tomó una muestra de esta dilución y se sembró hasta cubrir toda la superficie del agar Muller Hinton. Inmediatamente, se introdujo un sensidisco de cada antibiótico con concentraciones de 10 mg /ml para Penicilina, Gentamicina y Ampicilina y 15 mg/ml para Eritromicina. Pasadas 24 horas se revisó si los antibióticos produjeron halos (sensibilidad) o, si por el contrario, la bacteria generó resistencia. RESULTADOS

determinación de sus características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas específicas. Mediante la siembra directa por exposición con el ambiente se obtuvo un cultivo mixto, en el cual se visualizaron alrededor de 9 colonias bacterianas y 3 hongos. (Figura 1). Las características macro de la colonia seleccionada (Figura 2), se presentan en la siguiente tabla: Tabla 1. Características macro de la colonia de interés.

Forma Margen Elevación Superficie

Circular Ondulado Convexa Lisa, Brillante, Cremosa y Superficial

Del aislamiento de la colonia de bacterias se obtuvo crecimiento de la bacteria, como un cultivo puro en el agar nutritivo (Figura 3). Por el contrario, no se obtuvo crecimiento alguno en el agar Mac Conkey (Figura 4). Por medio de la tinción diferencial de Gram, se determinó que la bacteria estudiada corresponde a coco positivo para la tinción Gram, puesto que las bacterias se tornaron de color violeta y están dispuestas independientemente (Figura 5). Por otra parte, la tinción Ziehl Neelsen (Figura 6), resulto negativa, esto porque las bacterias no se tiñeron del color característico de la fucsina sino, de color azul, del azul de metileno. Los resultados de las pruebas bioquímicas se muestran en las Figuras 7,8 y 9, y en la siguiente tabla:

Para la identificación de bacterias, por lo general se requiere crecimiento bacteriano y por consiguiente se requieren medios de cultivo, para la 3

Tabla 2. Resultados de las pruebas bioquímicas. PRUEBA TSI

RESULTADO +

VIRAJE K/A

LIA SIMMONS UREA SIM TSA AGAR SANGRE INDOL CATALASA

+ + Fermentador +

K/K A/K A/K

OXIDASA

-

En la prueba de inhibidores bacterianos (Figura 11), se obtuvo un halo alrededor de cada uno de los cuatro sensidiscos ubicados en el medio de cultivo, las medias del diámetro de cada uno de los halos se presentan a continuación: Tabla 3. Diámetros de los halos de susceptibilidad de la bacteria estudiada frente a cuatro antibióticos y su categoría clínica

Antibiótico

[mg/ml]

Diámetro mm

Categoría Clínica

Penicilina

10

23

Resistente

Ampicilina

10

25

Resistente

Eritromicina

15

28

Sensible

Gentamicina

10

24

Sensible

Con base en la serie de pruebas diagnósticas realizadas, los resultados de las tinciones diferenciales, la morfología de la colonia bacteriana, su actividad bioquímica y su respuesta frente a los antibióticos, se llegó a la hipótesis de que la bacteria objeto de estudio podría pertenecer al género Staphylococcus.

El ambiente natural, inanimado y animado, es esencial para el mantenimiento de la mayoría de los agentes infecciosos como lo pueden ser las bacterias y para su transmisión de un huésped a otro (Winn y Koneman, 2008). Stanier & Villanueva (1988), definen un cultivo mixto como un cultivo que contiene más de una clase de microorganismo. Lo cual es coherente con lo observado en el medio de cultivo tras ser expuesto e incubado. En este contexto El género Staphylococcus, crea resistencia a la sequedad y se dispersa con facilidad por partículas de polvo a través del aire y de las superficies (Madigan et al., 2009). Lo cual puede ser un factor de su presencia en el medio de cultivo mixto. Con respecto a la morfología de la colonia del género Staphylococcus reportada en la literatura, se evidenció un alto grado de similitud al compararse con las características macro de la colonia estudiada. Lo anterior coincide con lo propuesto por Winn & Koneman (2008), quienes afirman que las colonias estafilocócicas suelen ser lisas, cremosas y tienen un perfil convexo poco sobre elevado y bordes netos, pueden producir colonias blanquecinas, grises o amarillentas. La obtención de un cultivo axénico en agar nutritivo se logró porque, este contiene nutrientes que favorecen el desarrollo de la mayoría de los microorganismos sin requerimientos especiales de cultivo. Por otra parte, el agar MacConkey evidencia el crecimiento de bacterias fermentadoras de lactosa e inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y hongos (Forbes, et al, 2009); esto explica el hecho de no crecimiento en este tipo de agar.

DISCUSIÓN 4

García, et al. (1999), argumenta que las tinciones compuestas o diferenciales son las más útiles para llevar a cabo la identificación y que el método Gram es la tinción más importante y más utilizada en microbiología, pues permite observar la morfología y diferenciar las bacterias en dos grupos de acuerdo a la concentración de peptidoglicano en su pared celular: Gram positivas y Gram negativas. Además (Seija V, 2008) afirma que los estafilococos son cocos Gram positivos, por esto, la tinción Gram fue determinante para asociar los resultados obtenidos, con los caracteres específicos de este género. Postulados de Cervantes, et al (2014), afirman que las bacterias del género Staphylococcus, están agrupadas como células únicas, en pares, tétradas, cadenas cortas o formando racimos de uvas. Lo que soporta las observaciones realizadas de la placa en seco en el objetivo de 100X, donde se pueden observar bacterias independientes separadas entre sí. La tinción de Ziehl-Neelsen o tinción de ácido resistencia se denomina así por la naturaleza química del decolorante, el cual es mucho más fuerte que el utilizado en la tinción de Gram. En se aplica fucsina ácida (colorante primario) que debe ser calentada para que penetre la célula y se fije fuertemente en los compuestos lipídicos de la pared celular de las bacterias ácido resistentes. En el siguiente paso de esta tinción se utiliza alcohol ácido como decolorante, pues es capaz de extraer el colorante primario de las bacterias no ácido resistentes; las ya decoloradas se tiñen con el colorante de contraste (Rodríguez et al., 2005). Acá se logró descartar el género Mycobacterium (para el cual esta prueba es positiva) y determinar que Staphylococcus no es una bacteria ácido-alcohol resistente por teñirse de color azul. El género Staphylococcus son bacterias no móviles, no esporuladas y no poseen cápsula, aunque existen algunas cepas que desarrollan una cápsula de limo

(Cervantes, et al 2014), lo anterior justifica el resultado negativo para la prueba de motilidad SIM. Igualmente, la respiración anaerobia facultativa está representada por la familia de Micrococacceae que comprende a los géneros Staphylococcus, Micrococcus, Stomacoccus y Planococcus (Quispe, 2014) esta condición se demostró en el diagnostico en agar tripticasa de soya, de acuerdo al crecimiento de las bacterias a lo largo y especialmente en el fondo del medio. Así mismo, la detección de catalasa permite diferenciar el género Staphylococcus (catalasa positivo) de los géneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa negativos) (Pahissa 2009). En esta prueba la enzima catalasa cataliza la liberación de agua y oxígeno a partir del peróxido de hidrogeno, dado que esta prueba es clave para el esquema de identificación de muchos microorganismos grampositivos, la interpretación debe ser cuidadosa (Forbes et al., 2009) esto llevó a soportar la hipótesis planteada sobre la identidad del género bacteriano problema. El resultado negativo en la prueba de LIA se puede explicar puesto que, LIA es un medio solido que se utiliza para diferenciar los microorganismos entéricos sobre la base de su capacidad de descarboxilar o desaminar la lisina. La prueba de urea determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea por acción de la enzima ureasa, produciendo un cambio de color a rojo o fucsia en el medio (Bailón, et al, 2009). Por lo tanto, la bacteria estudiada en esta investigación es ureasa positiva, esto lo confirman Winn y Koneman, (2008), cuando afirman que algunos estafilococos son ureasa positivos, incluidos S. epidermidis, S. intermedius y la mayoría de las cepas de S. saprophyticus. 5

El agar TSI se usa para determinar si un bacilo gramnegativo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa y forma sulfuro de hidrogeno (Forbes et al., 2009). Sin embargo, en el Cuadro 12-2 del diagnóstico microbiológico de Winn y Koneman (2008), se puede observar que la mayoría de especies pertenecientes al género Staphylococcus fermentan glucosa.

hemolisis por acción de las hemolisinas liberadas por las bacterias. Las colonias pueden producir una hemolisis total (β-hemolisis), o una hemolisis parcial (α-hemolisis) o no producir hemolisis (γhemolisis). En el género Staphylococcus se pueden producir los tres tipos de hemolisis, por tanto, según los resultados obtenidos, la bacteria de estudio se considera γ–hemolítica.

La prueba de Simmons resulta positiva para las bacterias que usan citrato como única fuente de carbono, como es un medio diferencial se nota una reacción alcalina de viraje azul en la zona en que se encuentran las colonias bacterianas (Laboratorios Britania S.A.). Esto puede indicar que la bacteria estudiada utiliza como fuente de carbono para realizar su metabolismo.

Los antibióticos son sustancias derivadas de un organismo vivo, generalmente microorganismo, o una modificación química de la misma que inhibe la reproducción, el crecimiento, o incluso destruye otras bacterias causantes de infecciones producidas por o células anormales (Ayres and Klajn, 2002). Igualmente, La resistencia de las bacterias es el principal obstáculo para la eficacia terapéutica de los antibióticos, pues no sólo puede anular la acción curativa si se manifiesta en el curso del tratamiento, sino que tiene a la larga consecuencias todavía más graves para el conjunto de la población, ya que provoca la desaparición de las cepas susceptibles y la propagación de las resistentes (Winn & Koneman, 2008).

Las bacterias que producen la enzima triptofanasa pueden degradar el aminoácido triptófano en acido pirúvico, como amoniaco e Indol, esta prueba se utiliza en numerosos esquemas de identificación, en especial para E. coli; lo cual explica que para géneros como Staphylococcus esta prueba no es muy frecuentada, por el contrario de la prueba coagulasa que es diagnostica en este género. La prueba de la oxidasa se utiliza en un principio para establecer la diferenciación entre bacterias gramnegativas, igualmente es clave para la identificación de especies de Neisseria, en esta prueba la citocromo oxidasa participa en el transporte de electrones y en la vía metabólica del nitrato de ciertas bacterias; Todas las especies de Staphylococcus son oxidasa negativas excepto las cepas de S. sciuri, S. lentus y S. vitulinus (Winn & Koneman, 2008). Esto respalda el resultado negativo en la prueba oxidasa. De acuerdo con Prats (2005), en los medios con sangre se puede observar se puede observar si alrededor de la colonia se ha producido un halo de

El antibiograma tiene como objetivo evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o a varios antimicrobianos, y traducir, en una primera aproximación, su resultado como factor predictivo de la eficacia clínica (Winn & Koneman, 2008). Para la interpretación del antibiograma se comparó los diámetros de los cuatro halos con la Tabla de Interpretación de los Resultados Método de Difusión en Agar (Brizuela-Lab, 2015) donde según la concentración de cada antibiótico se clasificó el diámetro critico establecido en resistente, intermedio o sensible (Tabla 1). Una bacteria es resistente cuando presenta mecanismos que impiden o dificultan el encuentro del fármaco con su blanco de acción, (Curtis, 2008) 6

en el caso de la penicilina su medio de acción es la inhibición de la pared bacteriana. Según Shoemaker, (2002), las bacterias pueden adquirir resistencia a la penicilina por diversos mecanismos, el más importante es la producción de enzimas denominadas b-lactamasas, las cuales actúan directamente sobre la molécula del antibiótico causando la hidrolisis del anillo b-lactamico, la mayoría de cocos Gram positivos siguen siendo sensibles a la penicilina. Por su parte la mayoría de cepas del genero Staphylococcus producen b-lactamasas, y por tanto son resistentes a la penicilina G y la ampicilina al ser este último un derivado semisintetico de la penicilina (García et al., 1997). Ahora bien los antibióticos aminoglucosidicos parentales más comúnmente utilizados son la Gentamicina, los aminoglucosidicos no pueden atravesa...