Efecto de la concentracion del sustrato sobre la actividad enzimatica PDF

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Enzima y sustrato...

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PRÁCTICA #4 Cinética enzimática 1: efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática OBJETIVOS: El alumno observará el comportamiento de la actividad enzimática de acuerdo a los parámetros de concentración tanto del sustrato determinando los valores de: • • • •

Vmax (velocidad máxima de la reacción) ½ Vmax Km (constante de Michaelis) [S] óptima (concentración óptima de sustrato)

PRERREQUISITOS La cinética enzimática es el campo de la bioquímica el cual se encarga básicamente de la medición cuantitativa de los índices de reacciones catalizadas por enzimas y del estudio de los factores que pueden afectar estos índices. De manera más específica o aplicada, la cinética enzimática representa el principal recurso para identificar agentes terapéuticos que inhiben de manera selectiva procesos catalizados por enzimas. Como se sabe, las enzimas son proteínas que modifican la velocidad de una reacción química utilizando una molécula sustrato para transformarla y generar un producto. Por ende, las enzimas van a poseer sitios de unión a sustratos en donde se va a llevar a cabo la reacción formando un complejo de enzima-sustrato. La relación que presentan estas dos moléculas es de gran importancia debido a que las concentraciones de ambas van a determinar la velocidad de la reacción. A nivel biológico, claramente nunca se va a contar con una concentración infinita de sustrato ni de enzimas por lo que las velocidades de las reacciones van a estar limitadas a ellas. A pesar de una alta concentración de sustrato que puede ser transformado a través de las enzimas, la velocidad de reacción tendrá un tope a lo cual se le conoce como saturación de la reacción, y es el momento en el cual se alcanza una velocidad máxima en la reaccion, es decir, la velocidad se vuelve constante debido a la diferencia en la proporción enzima-producto existentes. No existe la concentración suficiente para poder catalizar todas las reacciones y la velocidad se estanca, por lo que se afirma que la velocidad de la reacción será directamente proporcional a la concentración del sustrato. Las enzimas poseen una constante de afinidad (Ka) la cual nos determina que tan rápido puede reaccionar un sustrato específico con una enzima. Sin embargo suele ser de mayor conveniencia analizar la inversa de esta Ka la cual

hace referencia a la constante de Michaeelis-Menten (Km) debido a su práctico análisis metódico. Esto quiere decir que la Km será inversamente proporcional a la Ka, si obtenemos un Km elevado sabremos claramente que la Ka será muy reducida. La Km indica la concentración de sustrato en donde la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima, dándonos, como ya se mencionó una muy cercana aproximación respecto a la Ka que posee la enzima hacia el sustrato. RESULTADOS 1.- Graficar los valores de As vs. [S]

2.- Graficar los valores de 1/As vs. 1/[S]

Valores Y 1.8 1.6

1.675

R² = 0.9241

1.4 1.254

1.2 1 0.915

0.894

0.851

0.8

0.6 0.4 0.2 0 0

10

20

30

40

50

60

3.- Determinar los valores de: Vmáx Km ½ Vmáx [S] óptimo

Gráfica de M - M 1.174 0.02 0.587 1.092

Discusión Para poder crear un análisis de los resultados obtenidos en la gráfica de MichaeelisMenten tenemos que conocer el valor de la concentración óptima del sustrato de la invertasa (sacarosa). En la bibliografía no se menciona como tal un valor exacto de la concentración, sin embargo se han realizado investigaciones prácticas en donde se demuestra que la [s] óptima de invertasa a 1.0 g/L en promedio se encuentra en el valor aproximado de 0.05M y 0.1 M. en el eje Y, es decir, en el valor de la absorbancia, lo que nos dice que a esa concentración el complejo de enzimasustrato se encuentra presente en todo el medio, por lo que hay una saturación enzimática. En base a lo anterior se puede decir que la concentración de sacarosa que se introdujo en los tubos #3 y #4 fueron las más indicadas o cercanas para alcanzar una velocidad de reacción máxima. Esto porque se dijo que la [s] óptima de la invertasa es aproximadamente a una concentración de 0.05M y 0.01M y la concentración de sacarosa en el tubo #3 fue de 0.05 y 0.01.

Para los tubos 1, 2 y 7 se muestra en la gráfica que la velocidad de reacción es menor, esto se debe a que la concentración de sustrato también es menor, por lo tanto la formación de complejos de enzima-sustrato es disminuye y no se alcanza una saturación enzimática que nos permita observar una velocidad máxima de la reacción. Es por eso que se puede afirmar que la velocidad de la reacción es proporcional a la concentración de sustrato, sin olvidar que existe la excepción de esto cuando las concentraciones de sustrato son mucho mayores a las de la enzima.

Esta tabla fue sacada de la fuente de referencia que se tomó como base para discutir los resultados. Es aquí donde se expresa que en las concentraciones comprendidas entre 0.05M y 0.1M las velocidades de reacción son mayores en respecto a las demás cinéticas realizadas. Ver referencia #3 CUESTIONARIO 1. ¿La velocidad inicial de una reacción enzimática es dependiente exclusivamente de la cantidad de sustrato presente? ¿Por qué? No. Existen múltiples factores que influyen sobre los índices de reacciones catalizadas por enzimas como la temperatura y el pH. Se dice que el incremento de la temperatura aumenta el choque o la interaccion entre los sustratos y las enzimas por lo que aumenta la velocidad de reaccion, sin embargo si la temperatura aumenta demasiado, la energía cinetica de la enzima aumenta tambien llegando al grado de desnaturalización de la misma por la alteración de los enlaces covalentes que mantienen su estructura tridimensonal. Por el otro lado, las enzimas también poseen un pH óptimo en el cual trabajan a máxima capacidad influyendo de manera directa en la velocidad de reaccion; si la enzima no se encuentra en su medio de pH óptimo, claramente la velocidad en que llevara a cabo la reacción será más lenta.

2. ¿Cuál es la diferencia entre los cambios de energía libre que existen entre un proceso catalizado por una enzima y el mismo proceso no catalizado? Principalmente la energía libre de activación es la diferencia en energía que existe entre los reactivos y los productos. La diferencia entre ambos procesos radica en que un proceso catalizado por una enzima requiere de una energía de activación menor que los procesos en los que no existe catálisis, por lo tanto la velocidad de la reacción será mayor en el primer caso. 3. ¿Por qué a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km la velocidad de la reacción es independiente de la concentración de sustrato? La velocidad de reacción depende claramente de la concentración de sustrato, sin embargo lo hace hasta cierto punto. En el momento en el que la reacción llega al estado de saturación de la reacción, por más concentración que haya de sustrato, la velocidad ya no se modificará debido a que el proceso se encuentra en un tope en el que la velocidad solo pudiera incrementar si incrementa la cantidad de enzimas, sin embargo si recordamos, la cantidad biológica enzimática dispuesta para la reacción se encuentra ya determinada. 4. ¿La Km de una enzima varía con la concentración de enzima? ¿Por qué? No. La Km es característica de una enzima y particular para un determinado sustrato y refleja la afinidad de la enzima por el sustrato, por lo tanto es un parámetro invariable de la enzima. Es decir, si se tiene una enzima y un sustrato y la afinidad del sustrato es mínima, por gigantesca que sea la concentración del sustrato, la enzima no creará una mayor de afinidad por el sustrato. Referencias: 1. Murray, R. K., & Ral, P. G. (2004). Harper: Bioqumica ilustrada. Mxico: Manual Moderno. 2. Champe, P. C., Harvey, R. A., & Ferrier, D. R. (2005). Biochemistry. Philadelphia: Lippincott/Williams & Wilkins. 3. Martínez Limón , J., Morales Godos, F., & Durán Páramo, E. (2007). Caracterización cinética de la hidrólisis de sacarosa con invertasa libre e inmovilizada. Instituto Politécnico Nacional, México. Obtenido de http://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/123456789/14662/Binder1.pdf?sequenc e=1...