Práctica 8 efecto de la concentración de sustrato y la presencia de un inhibidor sobre la actividad enzimatica PDF

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IntroducciónEn las reacciones no catalizadas por enzimas la formación de productos depende linealmente de la concentración de sustrato añadido, entonces a bajas concentraciones de sustrato la velocidad es proporcional a la concentración de sustrato, entonces si se duplica la concentración se duplica...

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Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Bioquímica General Práctica 8 “Efecto de la [sustrato] y la presencia de un inhibidor sobre la actividad enzimática” Integrantes: -Espinosa Alvarez Oscar Grupo: 3FV1 -Pérez Ramírez Alexandra Itzel.

Introducción

Procedimiento:

En las reacciones no catalizadas por enzimas la formación de productos depende linealmente de la concentración de sustrato añadido, entonces a bajas concentraciones de sustrato la velocidad es proporcional a la concentración de sustrato, entonces si se duplica la concentración se duplica la velocidad (reacción de primer orden).

Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática

En las reacciones catalizadas por enzimas, se obtiene una dependencia hiperbólica de la velocidad respecto a la concentración de sustrato, en la curva a concentraciones intermedias de sustrato, la velocidad es independiente de la concentración de sustrato (reacción de orden cero), la velocidad alcanzada es cercana la Vmax

3. Agregar la enzima.

La interacción de un inhibidor y una enzima varía dependiendo de la naturaleza química del inhibidor y de la reacción química que cataliza la enzima, para dilucidar el tipo de interacción entre ambas moléculas se determina el efecto del inhibidor en las constantes cinéticas de la enzima. Tipo de inhibidor: competitivo, incompetitivo o acompetitivo y no competitivo.

Objetivos •

•

•

Determinar la concentración de sustrato en el cual la enzima alcanza su velocidad máxima. Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parámetros cinéticos de la enzima, así como el tipo de inhibidor que se produce. Determinar la constante de Michaelis-Menten (Km) de forma gráfica por los métodos de MichaelMenten y line weaver-Burk.

1. Preparar serie de tubos con los reactivos, sacarosa 0.2M y reguladora de acetatos 0.005M pH 4.7. 2. Pre-incubación por 5min a temperatura ambiente.

4. Incubación 5min a temperatura ambiente. 5. Inactivación con DNS agregar 0.5mL a cada tubo. 6. Reposar 5min a 92°C en baño maría. 7. Desarrollo de color, colocar en baño hielo y diluir con 2mL agua destilada cada tubo. 8. Leer en espectrofotómetro y anotar resultados. Inhibición enzimática 1. Realizar serie de tubos con soluciones, sacarosa 0.2M, inhibidor en regulador de acetatos pH 4.7 y agua. 2. Pre-incubación 5min a temperatura ambiente. 3. Agregar 0.5mL de la enzima. 4. Incubar 5min a temperatura ambiente. 5. Inactivación con DNS 0.7mL de enzima a cada tubo. 6. Baño maría 92°C por 5min. 7. Colocar en baño de hielo y diluir con 2mL de agua destilada en cada tubo.

8. Leer en espectrofotómetro y anotar resultados.

EFECTO DE INHIBIDORES EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA LINEAWEAVER-BURK

Resultados Abs

µ moles de azúcar reductor

Vo (UI)

Concentración (M)

1/Vo (UI)

1/[S] (M)

1

0.42

3.63

0.363

0.01

2.75

100

2

0.5

4.27

0.427

0.02

2.34

50

3

0.66

5.54

0.554

0.03

1.8

33.33

4

0.8

6.65

0.665

0.05

1.5

20

5

0.82

6.81

0.681

0.08

1.46

12.5

6

0.83

6.89

0.689

0.1

1.45

10

6

1/VO (1/UI)

Tubos

8

4 2 0

-150

-100

-50

-2

0

50

100

150

-4 -6

1/SACAROSA (1/M) Tabla 1. Datos para grafica de Michaelis-Menten. Gráfica 1. Lineaweaver-Burk. En donde se aprecia un inhibidor de tipo competitivo. Línea azul sin inhibidor y la línea naranja con inhibidor.

Discusión

Gráfica 1. Michaelis-Menten. La forma de la gráfica: (hipérbola rectangular) Dos zonas con diferente pendiente.

1/Vo 6.09 4.38 2.34 1.97 1.8 1.75

1/[S] 100 50 33.33 20 12.5 10

1/Vo 2.75 2.34 1.8 1.5 1.46 1.45

1/[S] 100 50 33.33 20 12.5 10

Tabla 2. Datos para grafica de Lineaweaver-Burk.

Lo que medimos es aparición de productos por minuto. Con la cantidad de producto obtenido podemos medir la actividad de una enzima. El regulador como acetatos mantiene el pH a 4.7 por zona amortiguadora, el agua ajusta el volumen, la pre-incubación sirve para que los reactivos tomen la temperatura ambiente para hacer que el tiempo (los 5min) sean constantes, se hace mediante intervalos conocidos de tiempo, adicionando la enzima 15 segundos cada tubo. La enzima no tiene activación en el tubo testigo porque ya tiene pH alcalino, desnaturalización- pierde su estructura terciaria y secundaria. Se ve color amarillo el color testigo porque no hay activación enzimática ya que no hay producción de glucosa, la glucosa es la que reduce el DNS haciéndolo de color rojo. Con nuestro inhibidor habrá poco color, el inhibidor que utilizamos es anilina. Un inhibidor hace que los sustratos no se peguen a la enzima y disminuyen la velocidad.

Una enzima no sufre transformación química durante la reacción que estén catalizando, eso hace que sean muy eficientes. El complejo enzima-sustrato se unen mediante la regla dictada por la estructura, la estructura debe interactuar de la estructura del sustrato, eso le da especificidad, tiene una estructura complementaria. interactúan en el sitio activo de la enzima y forman este completo por interacciones débiles.

• •

La anilina es un inhibidor de tipo reversible competitivo. La anilina puede fijarse tanto a la invertasa como el complejo-enzima sustrato.

Bibliografía -Rodwell W. Víctor. (2016). “Harper Bioquímica Ilustrada” 30ª edición, editorial Mc Graw Hill education Lange. México. D.F. pág. (58, 68-75, 82-85).

EFECTO DEL INHIBIDOR La anilina es reversible interacciona con la enzima por enlaces débiles Vmax con el inhibidor competitivo sí está o no el mismo inhibidor la Vmax cambia con un valor mayor si se encuentra el inhibidor y es menor al km cuando no está presente el inhibidor, los valores de km son iguales, no se modifican con inhibidor Acompetitivo. Con o sin inhibidor hay diferentes valores de Vmax y Km>Km con inhibidor. En nuestro caso al obtener la gráfica, observamos que se mostró un inhibidor competitivo en donde la línea de color azul es cuando está ausente el inhibidor y la línea de color naranja es la que va a ir presentando con inhibidor, entonces podemos determinar que sus Vmax es igual o casi similar con el Vmax del inhibidor (Vmax=Vmax con inhibidor), y que el Km es menor al Km del inhibidor (Km...