F2 UE60 - Amélioration des protéines thérapeutiques et biobetters PDF

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Fiche synthétique de biotechnologie sur l'amélioration des protéines thérapeutiques et biobetters...

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60 - BIOTECH

Fiche 2 – Amélioration des protéines thérapeutiques et « biobetters »

2016/2017

AMELIORATION DES PROTEINES THERAPEUTIQUES ET « BIOBETTERS » I.

GENERALITES

A. DEFINITION -

Biobetters ou Biosuperiors sont des versions améliorées d’un médicament biologiques d’origine qui vont améliorer sa pharmacocinétique et/ou son efficacité et/ou son mode d’administration et/ou sa toxicité et/ou son immunogénicité.

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Ces modifications ont différents objectifs : o Modification de la PK : ↑ t1/2,  élimination, limiter l’agrégation : les protéines agrégées passent par le système lymphatique à la place du sang, ce qui modifie le devenir in vivo. o Amélioration de l’efficacité : liaison au récepteur, spécificité, amélioration de la pureté o Diminuer les effets indésirables du médicament d’origine

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Il existe différentes approches pour développer les Biobetters o Nouveaux systèmes d’administration ou de formulation : améliorer l’efficacité, augmenter la protection, changer le mode d’administration, diminuer la dégradation… o Modification de la séquence d’ADN du gène :  Mutation, délétion  Création de protéines de fusion : fusion de 2 gènes qui contiennent la protéine thérapeutique à laquelle on a ajouté une séquence modifiant ses propriétés (chimères, anticorps hu manisés…)  Glycoingénierie : créer des séquences consensus de glycosylation au sein de la protéine ou éliminer une séquence de consensus, c’est-à-dire qu’on ajoute ou on enlève des sites de glycosylation o Ingénierie non-traductionnelle sur la protéine : c’est une modification APRES la production et la purification de la protéine :  Conjugaison aux polymères hydrophiles (ex : Pegylation)  Modification des chaines glucanniques déjà formées (la glycoingénierie est une approche traductionnelle alors qu’ici, on coupe en utilisant des enzymes par exemple)  Liaison à des lipides o Nouvelles technologies de recombinaison : au moment de la PRODUCTION  Systèmes hôtes génétiquement modifiés (capacité de glycosyler par exemple)  Nouveaux systèmes de production/d’expression

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Diminution de l’élimination par augmentation du volume hydrodynamique pour limiter la filtration glomérulaire : o Addition/modification de chaines glycanniques o Conjugaison à des polymères o Protéines de Fusion : Fcɣ, CTP, albumine, polypeptides… o Mutagénèse

B. APPROCHE POUR MODIFIER LES PK/PD DES PROTEINES

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Améliorer l’absorption ou la formulation o Pour avoir un mode d’administration plus efficace o Les Promoteurs d’absorption (non parentérale) - Détergents ioniques et neutres - Sels biliaires (ex : glycocholate…) - Cell penetrating peptiques (CPP)

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Ce sont des BIOBETTERS : les modifications apportées ont pour but de modifier les propriétés PK/PD de façon significative !

Cf F1 - Vu au cours précédent: le fait de modifier les excipients associés (=formulation) ne correspond pas réellement à des Biobetters. Sauf s’il y a une amélioration PK/PD nette. La frontière entre un biobetter et un non biobetter est floue car la notion de biobetter est récente. Il n’y a pas de réelle réglementation qui permet de distinguer ces deux domaines.

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Fiche 2 – Amélioration des protéines thérapeutiques et « biobetters »

2016/2017

C. GLYCOINGENIERIE -

2 moyens de réaliser la glycoingénierie o Modification de la séquence du gène o Ajouter des gènes de glycotransferase ou glycosidase dans la cellule hôte  Glycotransférase : enzyme qui ajoute un sucre donné sur la chaîne glycannique. Par exemple, on peut rajouter le gène de la sialyltransférase pour que la cellule puisse ajouter de l’acide sialique.  Glycosidase : enzyme qui enlève les sucres. Par exemple, on rajoute le gène de la mannosidase pour que la levure arrêter d’hypermannosiler les protéines (l’hypermanosilation est immunogène pour l’homme). EXEMPLES Exemple d’un Ac : - La plupart des Ac sont glycosylés au niveau d’une Asparagine (Asn) située sur la chaîne lourde. La majorité des chaines glycanniques retrouvées à ce niveau sont de type complexe : pentose de base (5 sucres) auquel viennent s’ajouter des antennes plus ou moins terminées. On parle de chaine de type complexe bi-antennée normalement bi-syalilée. - Si on ajou te à la cellule une transférase d’une N -acétyl-glucosamine, on pourra former une structure d’Ac plus proche d’un Ac humain que celui produit par une cellule mammifère. Exemple de modification de la séquence du gène : EPO de 2ème génération (Aranesp®) - L’EPO endogène possède 3 sites de N-glycosylation et 1 site de O-glycoslation. (N-glycosylation + volumineuses que Oglycosylation) - Création d’une séquence de consensus : ce n’est pas la seule condition pour avoir une N-glycosylation mais s’il n’y a pas d e séquence de consensus, il n’y aura pas de glycosylation. - On crée ainsi des analogues de l’EPO possédant 4 ou 5 chaines glycanniques au lieu de 3 : en augmentation le nombre d’acide sialique, on augmente les chaines négatives. Or ces chaines négatives vont inhiber sa filtration glomérulaire donc son élimination. On augmente également la masse et le volume hydrodynamique de la protéine : + le volume hydrodynamique augmente, + la filtration diminue.

D. MUTAGENESE : exemple de l’insuline -

But : modifier la durée d’action de l’insuline

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L’insuline existe sous la forme de 2 chaines A et B liées par des ponts disulfures  formation de dimères qui se transforme en hexamère, stabilisé en présence de Zinc.  Insuline sous forme d’hexamère est inactive : le site d’action est masqué par l’examérisation.  Dissociation de l’hexamère après départ du zinc : formation de dimères et de monomères actifs. o

Insuline à action rapide : A l’extrémité de la chaine B, on trouve une région riche en AA hydrophobes responsables de l’hexamérisation.  Insulin Lispro : la Lysine et la Proline sont inversées, ce qui perturbe l’association des AA hydrophobes  Isulin Aspart : la Proline (hydrophobe) est remplacé par l’Acide aspartique (hydrophile)  Insulin Glargine : ajout de 2 Arginines à l’extrémité terminale. Ils sont chargés positivement ce qui déstabilise l’hexamère.  Biobetter parce qu’on améliore les propriétés de l’insuline

o

Stabilisation de l’insuline : l’Asparagine se désamide facilement en Acide Aspartique. Pour éviter cette dégradation, on remplace l’asparagine par un AA qui ne se dégrade pas : la glycine.  Biobetter parce qu’on diminue les effets secondaires et les impuretés.

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60 - BIOTECH Fiche 2 – Amélioration des protéines thérapeutiques et « biobetters » 2016/2017 o Insuline à action retardée et prolongée :  Insulin Detemir : on remplace la proline par la lysine à laquelle on branche un lipide  les lipides sont hydrophobes et ont tendance à se regrouper (stabilisation de l’hexamère). Ils ont aussi une affinité pour l’albumine. On a donc une libération prolongée par la présence de l’hexamère, qui se dissociera en libérant la forme monomérique  liaison à l’albumine pour avoir un « réservoir ».  Biobetter parce qu’on retarde la libération du PA et on la prolonge.

II.

PROTEINES DE FUSION ET BIOBETTER

Les protéines de fusion sont des protéines artificielles issues de la combinaison de différentes protéines ou parties de protéines. Cette fusion est souvent obtenue par recombinaison de l’ADN d’un gène.

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3 approches sont exposées dans le cours : o fusion à l’albumine o fusion au fragment Fc (des anticorps) o fusion à des protéines inertes

A. FUSION A L’ALBUMINE -

La protéine se termine ou commence par de l’albumine. La fusion à l’albumine permet l’augmentation du t ½ de la protéine : o La t ½ de l’albumine est élevée pour une protéine (19 jours)  la protéine fusionnée à l’albumine obtiendra cette caractéristique o Elle suit le recyclage par la voie FcRN grâce à son affinité pour le réceptuer

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La présence du fragment Fc sur une protéine permettra la reconnaissance par un récepteur permettant le recyclage de la protéine.  En fusionnant la protéine au fragment Fc, on prolonge la t ½

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On peut lier notre protéine d’intérêt à une protéine quelconque qui aurait une propriété différente comme la charge, l’hydrophilie, la taille… Ces protéines sont des polypeptides inertes qui n’ont pas de fonction connus car ils ne sont pas présents de façon endogène chez l’homme. Ils ont été conçus uniquement pour former des biobetters. o XTEN : aussi appelé par abus de langage « PEG recombinant » car il a le même effet : il protège la protéine et empêche son élimination rénale, par augmentation de la masse et du volume de la protéine. o ELP (Elastin Light Peptide) o PAS : polymère de répétition d’AA qui permettent à la protéine d’avoir une taille plus importante.

B. FUSION AU FRAMENT Fc DES Ac

C. FUSION A UNE PROTEINE QUELCONQUE -

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Ces peptides sont non structurés, inertes et de taille élevée.

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CTP : il s’agit d’un polypeptide qui va donner une forte charge négative à la protéine à laquelle il sera fusionné.  La LH et l’hCG ne varient que de quelques AA. Pourtant, on observe que l’hCG a une forte affinité à son R contrairement à la LH et qu’elle possède de nombreux sites de glycosylations (contre 1 pour la LH). L’hCG a un t ½ beaucoup plus important que la LH  La différence entre les 2 est la séquence CTP, riche en sucre surtout en acide sialique qui porte tous les sites de glycosylation et permet de prolonger le t ½ .

D. FUSION A DES POLYPOPTIDES TRES ANIONIQUES

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A RETENIR Les protéines de fusion sont principalement utilisées pour augmenter la t ½ des protéines. L’ensemble de ces méthodes font l’objet de nombreux essais cliniques. MAIS : ces molécules sont plus complexes que la molécule de départ, et nouvelles (stabilité ? stabilité ?) : le risque est d’engendrer la production d’Ac = rester vigilant en ce qui concerne l’immugénicité.

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III.

Fiche 2 – Amélioration des protéines thérapeutiques et « biobetters »

2016/2017

CONJUGAISON CHIMIQUE DES PROTEINES A DES POLYMERES HYDROPHILES

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A noter : la conjugaison fait partie du domaine de la chimie, la fusion fait partie de la génétique.

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La conjugaison la plus courante est la PEGylation mais d’autres voies existent comme la conjugaison à d’autres polymères, notamment l’acide hyaluronique, l’amidon ou encore à des polymères d’ acide sialique.  Chez certains patients qui ont reçus des protéines PEGylées, on peut observer l’apparition d’Ac anti PEG : on recherche des voies de substition avec des biopolymères plus naturels pour l’homme (acide hyaluronique, amidon, acide sialique).

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La PEGylation concerne une grande partie des biopolymères vendus. Ils présentent plusieurs avantages :  Diminuer l’élimination en augmentant le volume de la protéine.  Réduction du pouvoir immunogène des molécules : le PEG va entièrement entourer la molécule et ainsi réduire son pouvoir immunogène notamment en masquant certains épitopes qui pourraient être reconnus et déclencher des RI.  Améliorer la solubilité : mise en place d’une couche hydrophile (le PEG est un biopolymère hydrophile) autour de celleci donc d’obtenir des formes plus concentrées qu’au départ (on peut mettre des concentrations + élevées lorsque la protéine est + soluble.  Augmenter la stabilité, 2 raisons :  Protection par rapport aux protéases ainsi que tous ce qui pourrait dégrader enzymatiquement notre protéine.  Une protéine qui a un repliement correct et qui a des chaines PEG tout autour va contribuer à maintenir la structure tertiaire dans un état stable.

A. PEGylation

B. LES DIFFERENTES PEGylations -

La PEGylation peut se faire sur la chaine N-ter ou C-ter, et au niveau de certains AA en particulier : o Sur la glutamine ou encore sur des cystéines  thiol PEGylation. o Un O-glycanne. On a ici une Serine qui est portée par un glycanne et dessus on va mettre une chaine PEG o Des N-glycannes donc sur une asparagine o Très fréquent : sur des amines comme la Lysine

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Les PEGylations peuvent être ciblées sur un AA en particulier ou être multi-sites. Le site de PEGylation, la manière ainsi que la nature du PEG vont être importants. On peut avoir plusieurs types de PEGylation : o Linéaires ou branchées o De taille variable o De positions variables o De chimie variable o Covalentes ou labiles

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Il est possible d’avoir des PEGylations qui pourront être coupées in vivo.

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En général, la PEGylation concerne des protéines de petites tailles qui sont éliminées facilement : l’interféron par ex.

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Fiche 2 – Amélioration des protéines thérapeutiques et « biobetters »

2016/2017

C. EXEMPLE DE PEGYLATION : interféron

Interféron alpha 2 a administré tous les 2 jours. Diminution de la concentration dans le sang au bout de 10h Répéter l’administration à 50h.

PEG linéraire de 5kDa

PEG linéaire de 12 kDa

PEG ramifié de 40 kDa

L’administration n’a plus besoin d’être répétée au bout de 50h mais au bout de 100h Diminution du nombre d’administration par un facteur 2.

Administration à répéter au bout de 168h

Maintien du taux plasmatique pendant une semaine ce qui permet une administration hebdomadaire

D. COMPORTEMENT DU PEG 1. 2. 3. 4. -

Internalisation du PEG  transport vers les endosomes puis les lysosomes dans lesquels il règne un environnement acide La PEGprotéine est métabolisée dans l’environnement acide Excrétion des métabolites + PEG PEG + PEGprotéine peuvent aussi être libérés sans métabolisation

Le PEG reste à l’intérieur de l’organisme ce qui peut expliquer pourquoi certains patients s’immunisent contre.

IV.

DOMAINE D’APPLICATION DES BIOBETTER

A. BIOBETTERS EN HEMATOLOGIE -

Les biobetters concernent surtout les facteurs de coagulation. o Fusion du fragment Fc avec le facteur 8 ce qui multiplie la t ½ par 1,5 : Eloctate® o Fusion du facteur 9 à l’albumine (médicament en phase 3) o De nombreux autres exemples de biobetters en développement clinique en hématologie sont disponibles : PEGylation, CTP, XTEN, hyperglycosylation…

B. COMPARAISON BIOBETTERS/BIOSIMILAIRES BIOSIMILAIRE Similaire au médicament d’origine Doit prouver sa bioéquivalence Moins long à développer Moins cher Non brevetable car similaire au produit de départ

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BIOBETTER Non similaire au médicament d’origine Doit prouver sa non-bioéquivalence en démontrant un apport thérapeutique : plus efficace, moins toxique… Plus long à développer car fait appel à des innovations fonctionelles en vérifiant qu’il n’y a pas d’EI Plus coûteux Brevetable car moins cher que le médicament d’origine et non similaire

Les biosimilaires et les biobetters coûtent moins cher que le médicament d’origine à développer ce qui explique sa protection par un brevet

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